HAT medium (original) (raw)
Le milieu HAT pour Hypoxanthine Aminoptérine Thymidine est un milieu de culture sélectif pour des cellules de mammifères, basé sur l'aminoptérine, une drogue qui agit comme inhibiteur sur le métabolisme de l'acide folique en inhibant la dihydrofolate réductase, ainsi que l'hypoxanthine et la thymidine qui sont des intermédiaires dans la synthèse des bases puriques de l'ADN.
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| dbo:abstract | HAT Medium (hypoxanthine-aminopterin-thymidine medium) is a selection medium for mammalian cell culture, which relies on the combination of aminopterin, a drug that acts as a powerful folate metabolism inhibitor by inhibiting dihydrofolate reductase, with hypoxanthine (a purine derivative) and thymidine (a deoxynucleoside) which are intermediates in DNA synthesis. The trick is that aminopterin blocks DNA de novo synthesis, which is absolutely required for cell division to proceed, but hypoxanthine and thymidine provide cells with the raw material to evade the blockage (the "salvage pathway"), provided that they have the right enzymes, which means having functioning copies of the genes that encode them. The enzyme dihydrofolate reductase, which produces tetrahydrofolate (THF) by the reduction of dihydrofolate, is specifically blocked by aminopterin. THF, acting in association with specific proteins, can receive single carbon units that are then transferred to specific targets. One of the important targets for cellular reproduction is thymidylate synthase, which creates thymidine monophosphate (TMP) from deoxyuridine monophosphate (dUMP). By additional phosphorylation reactions, TMP can be used to make thymidine triphosphate (TTP), one of the four nucleotide precursors that are used by DNA polymerases to create DNA. Without the THF required to convert dUMP, there can be no TTP, and DNA synthesis cannot proceed, unless TMP can be produced from another source. The alternative source is the thymidine present in the HAT medium that can be absorbed by the cells and phosphorylated by thymidine kinase (TK) into TMP. The synthesis of IMP, (precursor to GMP and GTP, and to AMP and ATP) also requires THF, and also can be bypassed. In this case hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) reacts hypoxanthine absorbed from the medium with PRPP, liberating pyrophosphate, to produce IMP by a salvage pathway. Therefore, the use of HAT medium for cell culture is a form of artificial selection for cells containing working TK and HGPRT. Many useful refinements to the scheme are made possible by poisons that kill cells, but to which they are immune if they lack one of these genes. Thus, a cell lacking TK is resistant to bromodeoxyuridine (BrdU) and a cell lacking HGPRT is resistant to 6-thioguanine (6-TG) and 8-azaguanine. Thus, selection with one of the latter two drugs, followed by HAT medium, will yield revertant colonies. (en) Le milieu HAT pour Hypoxanthine Aminoptérine Thymidine est un milieu de culture sélectif pour des cellules de mammifères, basé sur l'aminoptérine, une drogue qui agit comme inhibiteur sur le métabolisme de l'acide folique en inhibant la dihydrofolate réductase, ainsi que l'hypoxanthine et la thymidine qui sont des intermédiaires dans la synthèse des bases puriques de l'ADN. (fr) Il terreno HAT (ipoxantina--timidina) è una selezione di mezzi di coltura per linee cellulari di mammifero, che si affidano alla combinazione di amminopterina (un composto che agisce come potente inibitore del metabolismo del folato inibendo l'attività della diidrofolato reduttasi) con l'ipoxantina (un derivato della purina) e la timidina (un deossinucleoside), i quali sono intermediari nella .Il trucco è nel fatto che l'amminopterina blocca la sintesi de novo del DNA, assolutamente necessaria per la divisione cellulare, ma l'ipoxantina e la timidina forniscono alla cellula il materiale necessario per aggirare il blocco (la "via di recupero"), a patto che vi siano i giusti enzimi, cioè copie funzionali dei geni che codificano per essi. L'enzima diidrofolato reduttasi, che produce tetraidrofolato (THF) tramite la riduzione del diidrofolato, è specificatamente bloccato dall'amminopterina. Il THF, agendo in associazione con proteine specifiche, può ricevere delle singole unità di carbonio poi trasferite verso bersagli specifici. Uno dei più importanti bersagli per la riproduzione cellulare è la timidilato sintasi, che crea (TMP) dalla (dUMP). Tramite reazioni addizionali di fosforilazione, la TMP può essere usata per realizzare (TTP), uno dei tre precursori nucleotidici usati dalla DNA polimerasi. Senza il THF richiesto per convertire la dUMP, non ci può essere TTP, pertanto la sintesi del DNA non può procedere finché non viene prodotta TMP da un'altra sorgente. La fonte alternativa è la timidina presente nel mezzo di coltura che può essere assorbita dalle cellule e fosforilate dalla timidina chinasi (TK) in TMP. La sintesi di IMP (precursore da GMP a GTP e da AMP ad ATP) richiede anch'essa THF e può essere aggirata. In questo caso, l'ipoxantina-guanina fosforibosil transferasi (HGPRT) reagisce con l'ipoxantina assorbita dal terreno con , liberando pirofosfato, per produrre IMP tramite una via di riciclo. Pertanto, l'uso del mezzo HAT per le colture cellulari è una forma di selezione artificiale per le cellule che contengono TK e HGPRT funzionanti. Molti utili perfezionamenti dello schema sono resi possibili da veleni che uccidono le cellule, ma ai quali sono immuni in mancanza di uno di questi geni. Così, una cellula carente di TK è resistente alla (BrdU) mentre una carente di HGPRT è resistente alla (6-TG) e alla . La selezione tramite uno degli ultimi due composti, seguita dal terreno HAT, condurrà a . (it) |
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