Nick translation (original) (raw)
El desplaçament de tall (en anglès, nick translation) és un mètode marcatge de sondes d'ADN (per a genoteques) que es basa en la combinació de la i la , utilitzant un marcat. La DNAsa I crea osques en el DNA i la DNApol I sintetitzarà a partir del 3' lliure de l'osca eliminat el DNA que es troba per davant, fins al final de la cadena. Així queda la sonda marcada.
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| dbo:abstract | El desplaçament de tall (en anglès, nick translation) és un mètode marcatge de sondes d'ADN (per a genoteques) que es basa en la combinació de la i la , utilitzant un marcat. La DNAsa I crea osques en el DNA i la DNApol I sintetitzarà a partir del 3' lliure de l'osca eliminat el DNA que es troba per davant, fins al final de la cadena. Així queda la sonda marcada. (ca) Als Nick Translation wird in der Molekularbiologie eine DNA-Markierungstechnik bezeichnet. Dabei nutzt man die Reparaturfunktion der DNA-Polymerase I aus Escherichia coli aus, um markierte Nukleotide in Einzelstrangbrüche, sogenannte nicks, einzubauen. Die DNA-Polymerase I ist ein Enzym, das Einzelstrangbrüche oder Einzelstranglücken in der DNA, die zu Störungen bei der Transkription oder durch mechanische Beanspruchung sogar zum Abriss des DNA-Moleküls führen können, reparieren kann. Dazu besitzt die Polymerase eine 5'→3'-Exonuklease-Aktivität, bei der die Nukleotide vom 5'-Ende aus in Richtung 3'-Ende entfernt werden. Diese Exonuklease-Aktivität ist eine Besonderheit der DNA-Polymerase I. Sie ist nicht mit der 3'→5'-Exonuklease-Aktivität zum Korrekturlesen zu verwechseln, welche die DNA-Polymerase I ebenfalls besitzt. Der Strangbruch wird dabei nicht geschlossen (dafür wird eine DNA-Ligase benötigt), sondern verschoben. Daher die Bezeichnung Nick Translation. Gibt man als Substrat radioaktiv (3H, α-32P) oder durch ein kleines Molekül (Digoxygenin, Biotin, Fluoreszenzfarbstoff) markierte Nukleotide hinzu, werden diese eingebaut und markieren einen Bereich des DNA-Stranges. Die Markierungsintensität hängt von der Anzahl der Strangbrüche ab und dies wird durch die Konzentration an hinzugegebener DNase I bestimmt, die die nicks verursacht. Der Nachweis der Markierung hängt vom Marker ab. Die Detektion erfolgt z. B. durch ein Fluoreszenzmikroskop oder Blotting-Techniken. Dieses Markierungssystem wurde 1977 von Peter Rigby und Kollegen entwickelt. (de) Nick translation (or head translation), developed in 1977 by Peter Rigby and Paul Berg, is a tagging technique in molecular biology in which DNA Polymerase I is used to replace some of the nucleotides of a DNA sequence with their labeled analogues, creating a tagged DNA sequence which can be used as a probe in fluorescent in situ hybridization (FISH) or blotting techniques. It can also be used for radiolabeling. This process is called nick translation because the DNA to be processed is treated with DNAase to produce single-stranded "nicks". This is followed by replacement in nicked sites by DNA polymerase I, which elongates the 3' hydroxyl terminus, removing nucleotides by 5'-3' exonuclease activity, replacing them with dNTPs. To radioactively label a DNA fragment for use as a probe in blotting procedures, one of the incorporated nucleotides provided in the reaction is radiolabeled in the alpha phosphate position. Similarly, a fluorophore can be attached instead for fluorescent labelling, or an antigen for immunodetection. When DNA polymerase I eventually detaches from the DNA, it leaves another nick in the phosphate backbone. The nick has "translated" some distance depending on the processivity of the polymerase. This nick could be sealed by DNA ligase, or its 3' hydroxyl group could serve as the template for further DNA polymerase I activity. Proprietary enzyme mixes are available commercially to perform all steps in the procedure in a single incubation. Nick translation could cause double-stranded DNA breaks, if DNA polymerase I encounters another nick on the opposite strand, resulting in two shorter fragments. This does not influence the performance of the labelled probe in in-situ hybridization. (en) Il metodo della Nick translation è una tecnica di laboratorio di biologia molecolare che serve per operare la marcatura del DNA ovvero a creare sonde radioattive che potranno servire in seguito per esperimenti quali ad esempio il sequenziamento di un tratto di acido nucleico. La caratteristica che lo contraddistingue è quella di essere una tecnica capace di marcare fino alla totalità del filamento interessato, a differenza di altre tecniche di marcatura che interessano in primis le estremità 5' P o 3' OH del filamento. Vengono scelti per la marcatura degli isotopi radioattivi del fosforo, 32P marcati sul fosfato α del deossiribonucleotide. Data la radioattività della tecnica, si è preferito utilizzare in sostituzione dei deossiribonucleotidi legati a molecole che agiscono come fluorofori, al posto degli isotopi radioattivi del fosforo, capaci dunque di mostrare fluorescenza se sottoposti ad adeguata illuminazione in analisi. Il metodo si avvale di una sequenza di DNA doppio filamento, che una volta purificata viene ad essere tagliata con una endonucleasi a-specifica come la DNAsi capace di causare delle rotture a singolo filamento, in gergo chiamate proprio nick, generate dalla rottura dei legami fosfodiesterici. La presenza di un nick è il substrato di reazione per la DNApolI, che partendo dal punto di rottura inizia ad integrare via via i dNTP marcati sostituendo i nucleotidi presenti, non marcati: la capacità di rimozione, detta in gergo attività 5'-esonucleasica è una caratteristica intrinseca e distintiva di questa DNA polimerasi DNA-dipendente. La reazione può essere controllata inibendo chimicamente l'enzima, attraverso l'introduzione di in soluzione: questo causa la denaturazione della miscela enzimatica portando al termine della reazione. (it) |
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