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La prolyl-ARNt synthétase est une ligase qui catalyse la réaction : ATP + L-proline + ARNtPro AMP + pyrophosphate + L-prolyl-ARNtPro. Cette enzyme assure la fixation de la proline, l'un des 22 acides aminés protéinogènes, sur son ARN de transfert, noté ARNtPro, pour former l'aminoacyl-ARNt correspondant, ici le prolyl-ARNtPro.

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