Способ получения производных аминосахаров — SU 562202 (original) (raw)
011 Бб 2202 ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ Союз Советских Социалистических Республик(33) ФРГ Государственнык комитет Совета Министров СССР по делам изобретенийи открытий 3) УДК 547,963.0(088.8) вано 15,06,77, Бюллетень22 Дата бликовани писания 28.10.7(72) Авторы изобретени Иностранцымер, Бодо Юнге, Уве КойпВальтер Пульс и Дельф Шм(Ф Г) Луц Мюллет нер ф) Заявитсл Иностранная фирма Байер АГ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ АМИНОСАХАР Он г.н ОН Н ОН означает олигосахарид гексоз ными единицам в том, что организм семе й в водной питательной источники углерода, азую цепь сзаключаюства актиносреде, содера,соли ив де К п - 1 -щиися планац жащей Изобретение относится к способу получения новых производных аминосахаров, которые могут найти применение в качестве лекарственных препаратов и обладают улучшенными свойствами по сравнению с их ближайшими аналогами.В биоорганической химии известен ферментативный синтез олигосахаридов с использованием трансгликозидазы, где донором служат О-гликозиды любого типа, а акцептором - любое гидроксилсодержащее соединение.Описывается основанный на известной в биоорганической химии реакции способ получения новых производных аминосахаров общей формулы случае необходимости антпвспениватель, выращивают в аэробных условиях прп рН от 5,0 до 8,5 с последующим выделением целевого продукта известными приемами. В случае не обходи мости проводят микробактериальное,ферментативное или химическое разложение пли превращение высших звеньев гомолитического ряда в низшие звенья.Для проведения предлагаемого способа при меняют микроорганизмы принадлежащего кпорядку актпномпцетов семейства актинопланацей, в особенности штаммы для актинопланов, Примерами являются штаммы Ас(1 порапев зрес, ЯЕ 50 (СВ 5 961.70), 5 В 18 (СВЯ 15 957.70) и ЯЕ 82 (СВЯ 615,71).Для проведения предлагаемого способа,кроме того, можно использовать мутанты или варианты этих штаммов. Учитывая общий выход предлагаемых производных аминосахаров 20 и/или долю радикала К в смеси образовавшихся при ферментации производных аминосахаров, особенно пригодными оказались штаммы 5 Е 50/13 (СВЯ 614.71) и 5 Е 50/110 (СВЯ 674.73). Оба штамма в значительной 25 мере соответствуют описанию родового штамма 5 Е 50. Эти штаммы получают из штамма ЯЕ 50 естественным отбором, не применяя мутагенов.562202 19 20 Формула изобретения НО ОН Сн,НО Ы Е СН 7 ОН Н ОН ОН Составитель В. Деребин Техред 3. Тарасова Корректор Н. Аук Редактор Н. Белявская Заказ 1676/5 Изд. Уа 536 Тираж 563 Подписное НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 1. Способ получения производных аминосахаров общей формулы 1 где К означает олигосахарную цепь с п=1 -гексозными единицами, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что организм семейства актинопланацей в водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота, соли, выращивают в аэробных условиях при рН от 5,0 до 8,5 с по следующим выделением целевого продукта известными приемами.2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что как микроорганизм семейства актинопланацей берут организм вида актинопланес.10 3. Способ по и. 1, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что водная питательная среда содержит антивспениватель.Для проведения предлагаемого способаприменяют твердые и жидкие, в частности жидкие, водные питательные среды, которые наряду с источниками углерода содержат источники азота, соли и антивспениватели в обычных концентрациях. Концентрации могут колебаться в широких пределах.В качестве источников углерода служатпреимущественно углеводы, в частности крахмал, мальтоза, глюкоза и смеси из двух (или трех) из этих веществ, а также комплексные смеси, например солодовый экстракт.В качестве источников азота можно использовать обычно принятые в микробиологии комплексные смеси, например гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, пептон, рыбную муку, растворимые рыбные экстракты, воду от набухшей кукурузы, мясной экстракт и также смеси, кроме того, аминокислоты и/или аммониевые соли.При проведении предлагаемого способаобычно работают в аэробных условиях в проветриваемых культурах, выращенных при постоянном встряхивании, или в культурах, выращенных в сосудах. Род и концентрация углеродного источника в комбинации с применяемым для ферментации штаммом настолько влияют на род целевого продукта в отношении доли радикала К, что отдельные звенья гомологического ряда или по меньшей мере очень узкую область гомологов можно получать почти селективно, Оказалось, что в питательных средах, содержащих более 2% крахмала, образуются прежде всего производные аминосахаров с 4 - 7 единицами гексозы и что для этой цели особенно пригодным штаммом является ЯЕ 50/13 (СВБ 614.71), Однако при известных условиях для получения смесей производных аминосахаров с 4 - 7 единицами глюкозы достаточно к питательным средам, содержащим, например 3,5% глюкозы, в качестве источника основного углерода добавить 0,1 - 3 о/о, предпочтительно 0,5 - 2/о крахмала, Кроме того, оказалось, что в питательных средах, не содержащих крахмала, в частности после добавки мальтозы к питательной среде, в частности со штаммом ЯЕ 50 (СВ 5 961,70), преимущественно получают производные аминосахаров с 2 - 3 единицами гексозы. Особенно выгодными для получения предлагаемого производного аминосахаров с К-глюкозой оказались питательные среды, которые как источник углерода содержат только глюкозу, Если питательная среда содержит избыток глюкозы, то при более длительной ферментации образуются также производные аминосахаров с более длинной цепью. Это в определенных пределах можно предупредить, следя за тем, чтобы при ферментации истощение азотных источников совпадало с моментом истощения глюкозы. Если питательные среды не содержат глюкозы и в качестве углеродного источника служит мальтоза, то преимущественно получают производные аминосахаров с 2 единицами гексозы, причем чи 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 стую мальтозу можно заменить более дешсвыми смесями, например мальтцином, естественным солодовым экстрактом фирмы Диамальт АГ, Мюнхен, ФРГ. В зависимости от содержания малтотриозы образуется также следующий высший гомолог. Особенно выгодным для получения низших гомологов оказался штамм 5 Е 50/110, который в оптимальных питательных средах дает примерно вдвое больший выход низших гомологов, чем штамм ЬЕ 50/13.При ферментациях состав остальной питательной среды, в частности концентрация азотных источников, и состав солей могут колебаться в широких пределах.Питательные среды стерилизуются обычными способами, Значения рН питательной среды колеблются в пределах от 5,0 до 8,5, предпочтительно от 6,0 до 7,8. Температуры для выращивания составляют 15 - 45 С, предпочтительно 24 - 32 С, Для получения высших гомологов с штаммами ЯЕ 50 и ЬЕ 50/13 выгоднее работать при более высокой температуре, например при 28 С, для получения низших гомологов с штаммами 5 Е 50 и ЬЕ 50/110 при более низкой температуре, например при 24 С. Период выращивания составляет 1 - 8 дней, предпочтительно 2 - 6 дней. Более длительный период выращивания, в частности при избытке углеводов, благоприятствует образованию высших гомологов. Окончание ферментации определяют ферментативной пробой на наличие замедляющего действия и тонкослойной хроматографией.Низшие гомологи предлагаемых производных аминосахаров можно также получать из высших гомологов отщеплением единиц гексозы. Отщепление происходит с помощью водных кислот, в частности 1 - 5 нормальных минеральных кислот в течение 10 - 180 мин при температурах от 50 до 100 С, в частности при температурах от 90 до 100 С, или посредством инкубации ферментами (гидролазами), в частности р-амилазами или неингибируемыми а-амилазами или амилоглюкозидами микробного происхождения, например, а-амилазами из В. зцЬИ 1 з или посредством инкубации микроорганизмами. которые растут в питательных средах, которые предпочтительно как единственный источник углерода содержат высшие гомологи предлагаемых производных аминосахаров в количестве от 1 до 10%, предпочтительно от 2 до 5%, как, например, Аз. репр 11 пз п 1 дег (АТСС 11.394).Выделение и очистку предлагаемых производных аминосахаров осуществляют из микробиологических культурных бульонов или кислых гидролизатов, или инкубационных смесей, в которых проводилось ферментативное и/или микробиологическое разложение высших гомологов производных аминосахаров.В зависимости от пределов молекулярного веса, к которым относятся выделяемые вещества, необходимы различные методы разделе 5622025ция. Высшие гомологи выделяют непосредственным осаждением после предыдущих обесцвечивания и концентрации растворов.Низкомолекулярные гомологи получают предпочтительно адсорбцией на активном угле при нейтральном значении рН, при последующей десорбции водными спиртами или ацетоном, предпочтительно 50 - 80%-ным ацетоном. Десорбция удастся полностью при кислых зцачециях рН в пределах от рН 1,5 до 4, предпочтительно от рН 2 до 3.Если исходные растворы имеют очень темный цвет, их обесцвечивают до адсорбции предлагаемых веществ посредством активного угля при кислых значениях рН (рН 1 - 3) или неспецифическими адсорбционными смолами, например, 1.еюаро 1" Са 9221 (размер зерен 0,35 мм) фирмы Байер АГ, в пределах рН от 2 до 7, предпочтительно от 2 до 3. Активный уголь только в кислой области предпочтительно связывает красители, в то время как .ечаро 1 ни в нейтральной, ни в кислой областях не адсорбирует предлагаемые производные аминосахаров, имеющие ингибиторное действие.Для отделения ингибиторных производных аминосахаров от неактивных сахаридов и других неактивных соединений используют слабощелочной характер этих компонентов. При подходящих условиях (рН 1 - 8, предпочтительно рН 2 - 4; при слабой ионной силе, соответствующей электропроводности (10 мл сим, предпочтительно (2 мл сим) гомологические производные аминосахаров в Н+-форме связываются сильнокислыми катионитами, например, Рожехн 50 % (фирмы Рою Спепц- са 12). Как было установлено заявителем, имеющие замедляющее действие производные аминосахаров особенно хорошо связываются с катиоцитами из ацетонового раствора (50 - 80%-ный ацетон, рН 1 - 5, предпочтительно рН 2 - 4), которые при этих условиях обнару)кивают гораздо большую емкость для веществ. При условии, что раствор содержит более 50% ацетона, удается так)ке довольно хорошая связь с слабокислыми иоцитами, например, ЛгпегИе 1 КС(Н+-форма).Для десорбции предлагаемых производных амипосахаров из катионитов применяют водные основания или кислоты, предпочтительно аммиак или соляную кислоту в концентрациях 0,01 - 1 валин/л, Из элюатов получают ингибиторно-активные производные аминосахаров - после нейтрализации элюатов соответствующим слабокислым или основным ионитом или после удаления основания или кислоты вакуумной перегонкой в случае летучих оснований ики кислот - после концентрации раствора лиофилизацией или осаждением органическими растворителями, предпочтительно 10 - 20 объемными частями ацетона.Кроме того, цизкомолекулярные ингибиторно-активные производные аминосахаров отделяются от инертных сахаридов хроматографией ионитами на основе целлюлозы, предд О 15 20 ЗО аа 40 45 50 дд 60 65 почтительно фосфоцеллюлозы (фирма Серва, Гсйдсльбсрг). В качестве рдстворцтелейприменяют буферы, псрдц)чтптсгьно фосфатцые буферы с слаоой ионой силой, прсдпочтительцо 2 - 100 м.11, в 11 дсИостц 5 - 10 мМ, впределах рН от 2,5) до 8, прсдпочтцтсльцо прирН 5 - 6. Г 1 редпосылкой для эффективногофракциоцирОВднп 11 явл 51 стся кдк )Ожно малоесодерждццс солсй В црсц 11 рдтдх, цодвсргасмыхфракциоцировдццО, В то в)смя к 11 к кр 1 сптсгипочти цс мсшдОт.Для получсцця отдсльцых звеньев предполагаемого гомологцчсского ряда пшцбцторноактивны.; производных амццосахаров в чистомвиде прсдварцтсльно очцщсццыс препаратыхромдтографпруют цд чрцгодцом молскулярцом сите, цапрцмср В 10-)с 1 Н Р(фирмыБцо-Рад, МОхсц), и тоцкослойной роматографпей цсслсду 1 от фракции элюата. Фракции,содерждщпс чцстыс процзВОдцые аъНпосахаров, соединяют, повторно хроматографируюти после концентрации лиофилизцруют или,как бьПО Опис 2 ИО Вьцпе, осджлдОт Органическим растворцтслсм.В следую.цпх примерах гексозцые единицыпредставляют собои глОкозш 1 е едцпицы.Г 1 р ц м е р 1. В 1 скоторых примерах в качестве цсходцой смеси применяют препарат,получасмьш следу 1 ощпх ооразом,В стекляццыц фсрмс; тср с 8 л питательного раствора, состоящсго цз 55 в крахмала, 1,0 О/одрож"сеВОГО эстр 21 т 2, 0,2 /1) К 2 НР 04, из качалочцой колоы подают трехдцевный штаммЯЕ 50/13 (СВ 5 614.71) и при тщательном размешиваццц и цровстрпвдшш пнкубпруют втечение 3 дней прп 28 С, прп этом получаюткультурал.НуО жидкость с 105000 ед. Инг.а мцлазы/мл.6 л этОЙ 11)срмсцтдцпоццой жидкости пос 1 еОхлдждеция до 20 С подкисляют полуконцентрированнои НХО, (р 1-1 2,5), добавляют 30 гкарборафцццроваццого активного угля, персмешцвают в течение 10 мцц, центрпфугцруютв течение 15 мцц прц 10000 оо/мцн и прозрачный светло-желтый остаток после нейтрализации Х 11 э сгущают до 500 мл, 500 мл концентрата в течение 45 )ц смешивают с 200 г амберлпта 1 ЯЛ 410 С 1 - , фильтруют на нутче иприбавляют 4,5 объсмцых части (около400 мл) метанола, чтобы осадить основное колпчество цысокомолекулярцых продуктов расщепления крахмала (вместе с сщс Наличнымиостатками актпшого угля). Цецтрцфугируютв течение 5 мцн прц 5000 оо,мцц, 850 мл остатка при тщательном р 121 ешцвдцпп по каплямдобавляют к 4 л сухого спирта, Белый хлопьевидный осадок фильтруют ца путче, 3 разапромывают спиртом, 2 раза эфиром ц сушатв вакууме прп 50 С. Выход 36 г бслого порошка с 10 10 сд. Ицг. амцлазы/г.П р ц м е р 2. Для оцсцкц целевого продуктаферментаццй и состава прспдратов тонкослойцой хроматогра 11)цс 1 мл фсрмсцтаццоццыхжидкостсй 1 ПИ 1 мг п)спс 1 рдтов цапосят ца спликагельные плецкп (фирмы ЯС 1)1 сС 11 сгдЭ б 0 65 7ЬсЫе 11, Ваззе, Тур Г 1500) и 2 раза проявляют в системе н-бутанол/этанол/вода =50: 3: 20,Для цветного изображения ицгибиции сахаразы проявленную и хорошо высушенную пластинку (20 м/20 Х 20 см) опрыскивают фермсцтативцым гелем и дают ему отвердеть.Затем в течение 5 мин при комнатной температуре предварительцо ицкубируют во влажной камере и затем до насыщения опрыскивают субстратцым гелем. После отвердения второго слоя геля пластинку помещают в влажную камеру и ицкубируют цри 40 С. Ингибициоццая окраска (светлые пятна, краснокоричцсвый фон) проявляется через 60 - 90 мцц. При оптимальном проявлении цвета прерывают процесс и пластинку с находящимися ца ней агаровыми слоями сушат горячим воздухом.Приготовление гелей.Фермецтатцвный гель - 1,5 г агарозы(Г 1 пс 1 цзг 1 е В 1 ооц 1 цце ГгапсаЬ) суспендируют в 100 мл 0,2 М 1 Х 1 а-малеинатного буфера со значением р 1-1 6,0 и затем растворяют при кицячснци. Прозрачный агаровый раствор охлаждают до 50 С и при перемешивании добавляют 250 мл тритон л-раствора (2 г тритона Х+8 г этанола) и 0,5 мл дианизидццового раствора (20 мг дианизидина/1 мл ацетона). 1.1 епосредственно до употребления геля добавляют 1 мл СгОР/РОР-реактива (12,5 мг оксидазы глюкозы, степень чистоты 1, фирмы Берицгер, Ы заказа 15423 и 2,5 мг цероксидазы, степень чистоты 11, фирмы Еерицгер, М заказа 15302, растворенные в 5 мл малеицатцого буфера) и 4 - 6 единиц сахаразы цз тонкого кишечника свиньи. До опрыскивания гель нужно выдерживать при температуре 50 С, так как иначе он при процессе опрыскивания затвердевает в соплах.Субстратцый гель; 0,5 г агарозы суспендируют в 100 мл гха-малеинатного буфера с рН 60 и растворяют при кипячении, охлаждают до 50 С, добавляют 100 мл тритона (2 г тритона Х+8 г этанола) и добавляют 1 г сахаразы (фирмы Серва Мд 35579). После растворения сахаразы гель готов к применению.Для цветного изображения ингибиции ами.лазы ггроявленную и высушенную ТХ-пластинку опрыскивают амилазным гелем (20 мл/20 Х Х 20 см пластинка) и оставляют отвердеть.После пятиминутной предварительной инкубации; при комнатной температуре пластинку, покрытую слоем геля, погружают в 0,5%-ный крахмальный раствор (1 г крахмала фирмы Мерк Ло 1252 в 200 мл 0,2 М глицерофосфатного буфера, 0,01 М СаС 1 рН 6,9, растворенных при кипячении) и выдерживают в нем в течение 2 мин при 40 С, перемешивая раствор. Затем пластинку хорошо промывают дистиллированной водой и для окрашивания не- расщепленного крахмала погружают в разбавленный 1-ра твор (4 мл ),-раствора на 500 мл Н,С; Л:-раствор: 2,2 г 1+4,4 г КЛ, растворенных в 100 мл НО). Через 1 мин получают оптимальную окраску. 510 15 20 25 ЗО 35 40 45 50 8Приготовление амилазного геля1 г агарозы ри 100 С растворяют в 100 мл 0,2 М натрийглицерофосфата/0,01 М СаС 1-буфера со значением рН 6,9, после охлаждения до 50 С добавляют 100 мл тритона -100 (2 г тритона Х+8 г этацола). Непосредственно до опрыскивания добавляют 100 мл суспензии амилазных кристаллов (10 мг амилазы из поджелудочной железы свиньи/мл цасьпценного ХН 4-сульфатцого раствора фирмы Берицгер, Мо 15017).П р и м е р 3. В колбу Эрленмейера емкостью 1 л с 120 мл питательной жидкости, состоящей из 4/О крахмала, 2,4/о глюкозы, 0,9/о гидролизата казсина и 0,9/о дрожжевого экстракта, значение рН которой посредством МаОН установлено на 7,6, к которой добавлено 0,4% СаСОз и которая стерилизована в течение Ю мин при 121 С, засевают 3 мл предварительного штамма ЬЕ 82, выращенного в питательной жидкости из 2/о крахмала, 1/о глюкозы, 0,5 /о гидролизата казеина и 1 О/о дрожжевого экстракта, значение р 11 которой посредством МаОН доведено до 7,2, к которой добавлено 0,4/о СаСОз и которая стерилизована в течение 30 мин при 121 С, и инкубируют в течение 5 дней при 28 С на качалке. Получают культуральный раствор с 122000 ед. инг. амилазы/мл,Для дальнейшей переработки мицелий центрифугированием при 12000 об/миц отделяют от соединенных культуральных жидкостей, 300 мл культурального фильтрата подкисляют полуконцентрированной азотной кислотой до рН 2,5 и в течение 10 мин перемешивают с 2,5 г активированного угля, После отделения угля при 12 000 об/мин к раствору, нейтрализованному до значения рН 6 посредством 10 н. КОН, добавляют 300 мл метанола, выдерживают в течение короткого времени и при 12000 об/мин удаляют осадок. Остаток по каплям добавляют к 3 л этанола, осадок после непродолжительной выдержки центрифугируют при 12000 об/мин, два раза промывают абсолютным этанолом и один раз эфиром, сушат в вакууме, получают 2,23 г продукта с 7,45 10 ед. инг. амилазы/г, который более чем на 95% содержит гомологи производных аминосахаров с г) 4. Пример 4. В колбу Эрленмейера емкостью 1 л с 120 мл питательной жидкости, состоящей из 3,5% глюкозы, 2/о крахмала, 0,5% гидролизата казеина, 1,3% дрожжевого экстракта, О,ЗО/о СаСО, и 0,3%КНРО, значение рН которой до стерилизации устанавливают на 7,8 и которая стерилизоваца в течение 30 мин при 121 С, засевают 6 мл предварительной культуры штамма 8 Е 50/110, выращенной в питательной жидкости, состоящей из 3/О соевой муки, 3% глицерина и 0,2 О/о СаСО и инкубируют в течение 3 - 4 дней при 24 С на качалке. Получают культуральный раствор, содержащий 153000 ед. ицг. амилазы/мл Ф 12200 ед инг. сахаразы/л, 56220230 ЯЕ 50ЯЕ 50,13ЯЕ 50,110 БЕ 50ЧЕ 50(13ЯЕ 50(110 П р ц м е р 9. В ферментер с 100 л питательной жидкости, состоящей цз 3,5 оо глюкозы, 2,5 о/о сухого порошка солодового экстракта, 55 0,5 /о гцдролнзата казеица, 1,3,о дрожжевогоэкстракта, 0,3/о СаСОз, 0.3 /о К.НРО, и 0,1/о антнвспеццвателя, засевают 5 л предгарцтельной культуры по примеру 4 ц прц размсшцваниц и проветривании в течение 5 дцсй цц кубируют при 24 С. Получают культуральцыйраствор с 73000 ед. ццг. сахаразы(л, который преимуц 1 ественно содержит производное амццосахаров с п = 2.90 л ферментаццонной жидкости с мпцелц ем концентрированной азотной кислотой под 1 л культурального раствора подкисляют азотной кислотой до рН 2,5, в течение 10 мин перемешивают с 5 г активированного угля и затем в течение 30 мин центрифугируют при 5000 об/мин, Нейтрализуют 25 г амберлита 1 КА 410 (ОН - -форма). Остаток упаривают до 100 мл, добавляют 100 мл метанола и фильтруют. Фильтрат прибавляют к 2 л спирта, выпадающий осадок фильтруют на нутче, три раза промывают ацетоном и эфиром и сушат в вакууме.Выход 14 г белого порошка с 5 10 ед, инг. амилазы/г, который преимущественно содержит гомологи с п 4.П р и м е р 5. Работают аналогично примеру 4, однако с добавкой 0,5 о/о крахмала и после четырехдневной ферментации получают культуральный раствор с 40000 ед. инг. амилазы и 184 ед. ицг. сахаразы/мл. Культуральный раствор содержит гомологи, начиная с п) 1.П р и м е р б. В колбу Эрленмейера емкостью 1 л с 120 мл питательной жидкости, состоящей пз 3/о глюкозы, 0,6/о гидролизата казеина, 1,6 /о дрожжевого экстракта, 0,3/о СаСОз, 0,3 /о КНРО, значение рН которой до стерилизации посредством КОН доведено до 7,8, засевают предварительной культурой штамма 5 Е 50/110 по примеру 4 и инкубируют в течение 4 дней при 24 С на качалке. Получают культуральный раствор с 10 800 ед. инг. сахаразы/л, который преимущественно содержит производное амицосахаров с п=1.5 л культурального фильтрата при 1300 об/мин отделяют от мицелия, полукоццецтрироваццой азотной кислотой раствор подкисляют до рН 2,5 и в течение 15 мин размешивают с 55 г активированного угля (фирмы Мерк) и 200 г С 1 агсе 1 а. После удаления твердых веществ отсасыванием раствор нейтрализуют концентрированным аммиаком до рН 7, упаривают до 1,5 л ц осаждают пятикратным количеством этанола. Полученный хлопьевцдный осадок отделяют центрифугированием при 1200 об/мин, желтоватый остаток упаривают до 150 мл и для отделения незначительных нерастворимых частиц центрифугируют с небольшим числом оборотов. 50 мл этого раствора наносят ца наполненную амберлцтом 1 Р. (Н+-форма) колонку (ЗОХЗОО мм;30 мл НО в час). Собирают 300 мл элюата, содержащего инертные сахариды, а также долю неадсорбированных ингцбиторно-активных компонентов, ионит примерно с 400 мл воды вливают в химический стакан ц при размешцвании добавляют концентрированныц аммиак до рН 11,5. Перемешивают еще в течение 30 мин и отделяют ионит, остаток концентрируют до 1/20 объема, фильтруют через колонку (20 Х 150 мм), наполненную амберлитом 1 КЛ(НСОз-форма), и при скорости 30 мл/час собирают 500 мл элюата, который концентрируют и затем лиофилизируют, причем получают 1,3 г сырого продукта.Для дальнейшей очистки сырой продукт фракционируют с В 1 о-рте Р100 - 200 мец(фцрмы Бцо-Рад, Мюнхен). Для этой целиприменяют колонку диаметром 50 мл п длиной 450 мм, которая работает ца воде прцскорости 40 мл/час, причем собирают фрак 5 ццц по 10 мл. Все фракции посредством антроновой пробы исследуют на наличие углеводовц посредством пробы по замедлению сахарозы на наличие ццгибиторно-активных компонентов.10 Фракции, содержагцце ццгцбптор сахаразы,кроме того, тоцкослойцой хроматографиейаналогично примеру 2 исследуют ца содержание отдельных компонентов. Фракции, содержащие производное амццосахаров п=1, сое 15 диняют, концентрируют ц лцофцлцзцруют. Получают 35 мг производного амццосахаров сп=1 с 0,3 10 ед. пнг, амплазы,г ц 30000ед. инг. сахаразы/г.П р и м е р 7. В колбу Эрлепмейсра с 120 мл20 питательной жидкости, состоящей цз 5 о захмала, 1 /о дрожжевого экстРакта, 0,2/оК,НРО засевают по 2 мл предварительнойкультуры по примеру 4. После трехдневнойинкубацци прц 28 С получают культуральцые25 растворы со следующим выходом амцлазцогоингибцтора (преимущественно состоят пз производных амццосахаров с и) 4),П р и м е р 8. В колбу Эрлецмейера емкостью 1 л с 120 мл питательной жидкости, состоящей из 1,3/о мальтозы, 3,5/о глюкозы, 0,5 ооо гидролпзата казецна, 1,3 о/о дрожжевого экстракта, 0,3/, СаСО 0,3/о К.11 РО засе вают по 2 мл предварительной культуры попримеру 4. После четырехдневной цнкуоаццц при 24 С на качалках с разлцчцымц штаммамц получают растворы со следующими выходами цнгцбиторов (преимуцествсцно состоя цз производных амцносахаров с п(4),Штамм Ингнбнтор саха- Ингибиторразы, елЬл амнаазы, ед ма25 580 ф 14,8 1460кисляют до рН 2,5 и добавляют 900 г (1%) активированного угля (фирмы Мерк) для адсорбцпп основного количества образовавшихся красителей. Перемешивают в течение 15 мип, центрифугой пртл 3000 об/мин отделяют мицслий и основное количество угля и остаток прп лооавке 3 кг С 1 агсеГа фильтруют через путч-фильтр, раоотающий под давлением, Получают 65 л желто-коричневого, прозрачного фильтрата с 60000 ед. инг. сахаразы/л, фпльтрат концентрированным аммиаком доводят ло рН 7 и лля алсорбции активного вещества в тетение 30 мин перемешивают с 1300 г (2 о/о) активнрованного угля (фирмы Мерк). Фильтруют через путч, работающий под давлением, и осадок активировапного угля 3 раза промывают 1 О л дистиллированной воды, Затем уголь прессуют досуха и три раза, какдый раз в течеттие 15 мин перемешивают с 4 л 50%-ного ацетона при рН 2,5, чтобы лесороировать действующее вещество от угля.После удаления угля Йильтрацттей апстоновые элюаты объелиттяют, Объединенный элюат упаривают ло 250 мл, добавляют равный объем (250 мл) метанола и фильтпуют через складчатый фильтр. Фи:тьтрат (480 мл) при тщательном размсшиванип по каплям добавляют к 5 л ацетона. Вычавшпй осадок фильтруют через путч тт 3 раза промывают ацетоном и эфпрох сЗ атем с 1 тат В Вя 1 лтмс при 35 С. Выход 230 г с 8500 ед, ппг. сахаразы/г, 25 г сырого продукта растворяют в 1 л Воды и в тстсттие ЗО мнн ттспсмсшнвают с 300 г Эоюехн 50 Ч. 4 11+ 1200 - 400 меш). Отфильтровывают смол и три паза промывают 2 л 0,001 и. ПС 1. Промт.ттьн"т ГЭол сх затем суспендируют В 500 мл вольт, и суспензпю ло- баВЛЕНИЕМ 25 ОтоО-ПОГО раСтВОра аММНаКа дОВО- дят ло рН 9,0. Затем ещс 2 раза лссорбируют с 500 мл 0,6%-ттого раствора аммиака, элюатьт объедитттнот и упарпвают до 100 мл. Для обесцвсчивання раствооа его в течеттие 5 мин петтеметттивают с 2 г ОЛЕ-ттеллтолозьт (фирмт.т П 1 лейтхер 11 1 пюль % 02035, 0,6 мвалин/г) и затем ттентрифугируют. К светло-тселтом остатку добавляют равньттт объем (100 мл) метаттола и затем пои тщательном перемешивании по каплям добавляют 2 л ацетона. Осадок фильтруют на г,тчс, промывают ацетоном и эфиром и при 35 С сушат в вакууме.Выход 4,2 г с 26 000 ед. инг. сахаразы/г. Для дальнейшей тотткой отистти 4,0 г ингибитора по порциям 0,5 г подвергают гель-фттльтрацтли чеоез бттогелт. Р. Для этой ттели 0,5 г препарата растворяют в О м.т 110 и наносят на колонну с бпогслсм Р(200 - 400 мент, Фттрмы Био-Рад) диаметром 5 см и длиной 95 см. Проявлятот в воле пои степени текучести 80 мл/ч. Сос 1 пратот 12 мл фракции. У всех фпаКПИй ОнттЕДЕЛЯЮт ОтттттоЕ СОДЕРгтСаНтЛЕ УГЛЕВодов (антроттовой прооой как эксттттттсция п 1 ти Еоро), а татстсс солсро 1(антс. ттнгибттора сахаразы и амилазы. Кроме того, фракции подвергают тонкослойной хроматогпафии (окраска ингиоитора ферментов по примеру 2). 5 10 15 2 ст 2 о 30 35 40 45 50 55 60 65 12Фракции, в которых находятся производные аминосахаров с п=4 - 6, объединяют, упаривают до 10 мл и осаждают прикапыванием к 200 мл спирта. Осадок удаляют центрифугированием, промывают ацетоном и эфиром и сушат в вакууме; выход из 4,0 г сырого ингибитора: 0,2 г производного аминосахаров с п = 4 - 6 с 17,5 10 ед. инг, амил азы/г и 8500 ед. инг, сахаразы/г, Фракции, содержащие производное аминосахаров с п=З, обрабатывают тем же способом, причем осаждение ведут 200 мл ацетона; выход из 4,0 г сырого ингибитора: 0,1 г производного аминосахаров с п=З с 1,4 10 ед. инг. амилазы/г и 21000 ед, инг. сахаразы/г. Из фракций, содержащих производное аминосахаров с п=2 (осаждение ацетоном), выделяют 0,9 г производного аминосахаров с п=2 с 0,3 10 ед. инг, амилазы/г и 68000 ед. инг, сахаразы/г.П р и м е р 10. В три небольших ферментера, каждый из которых содержит 8 л питательной жидкости из 7,5 о/о сухого порошка солодового экстракта, 0,3% гилролизата казеина, 0,7 /о дрожжевого экстракта, 0,3/о СаСО, 0,3% КНРО 4, засевают 5/о предварительной культуры штамма ЯЕ 50/110 (получен согласно примеру 4). После пятидневттой пнкубации при 24 С получают культуральный раствор с 73 ед. инг. сахаразы/мл, который преимущественно содержит производные аминосахаров с п=2.После центрифугирования (30 мин, 3000 об/мин) для отделения мицелия получают 20,5 л интенсивно-коричневого культурального раствора с 67 000 ед. инг. сахаразы/л. Добавлением азотной кислоты рН доводят до 3,5 и для ооесцвечивания добавляют 60 г 1 егароГа (Са 9221, зернистость 0,35 мм, фирмы Байер)/л=1,23 кг 1.еъчароГа, После двадцатиминутного перемешивания фильтруют через нутч-фильтр Зейтца К 3. Обесцвеченный культуральный раствор нейтрализуют аммиаком (18,5 л, 67000 ед. инг. сахаразы/л). Затем для адсорбции активного вещества добавляют 20 г активного угля/л=370 г и перемешивают в течение 30 мин, отфильтровывают через фильтр Зейтца К 3, на который был нанесен слой фильтровального вспомогательного вещества С 1 агсе 1, фильтрат удаляют (17,5 л, 3600 ед. инг. сахаразы/л), Угольный остаток три раза промывают 2 л дистиллированной воды. Для десорбции активного ветцества от угля его последовательно 3 раза по 15 мин промывают 1 л 80%-ттого ацетона, причем значение рН концентрированной НС 1 доводят до 2,5. Элюаты объединяют (2,4 л 371 000 ед, инг. сахаразы/л). К элюату добавляют 20 г дауэкса (Н+) (дауэкс 50%Х 4, Н+-форма, фирмы Серва, Гейдельберг) =46 г дауэкса и перемешивают в течение 20 мин. Затем отфильтровывают смолу (фракттия дауэкса 1) и промьтвают небольшим количеством 75%-ного ацетона. Фильтрат и промывную жидкость (3 л =215 000 ед, инг, сахаразы/л) смешивают с 60 г амберлита 11 сА 410 (ОНформа, фирмыВыход Объем, л Культуральный раствор После обесцвечиванияпосредством 1.еюаго 1 а После адсорбции активированным углем ДесорбатТо же 10095 20,5 1 373 5001 306 500 67 000 67 000 19,5 4,8 (удалено) 18,5 66 600 3 600 519 400296 100 883 50068 000890 400645 000 0,7 0,9 0,8 2,4 3,0 742 000 329 000 85 000 371 000 215 000 37,821 6 64 45,064,8 Смешанный элюат (4 - 6)После 1-й адсорбциидауэксомПосле нейтрализации1 КА ОН 2,8 219 000 27 000 613 200 После 2-й адсорбциидауэксомОбъединенные аммонийные элюатыфракции 1 дауэкса фракции 1 дауэкса Осагкдениефракция 1фракция 1 4,9 (удалено) 67 500 0,29 0,45 197 80 638 550 162 500 442 800 682 0001 419 000 60,9 25 000/г 36 000/г 6,5 г 12,3 г Серва, Гейдельберг)/л до установления значения р 11 7. Затем отфильтровывают и к фильтрату (2,8 л, 219000 ед. инг. сахаразы/л добавляют 72 г дауэкса Н+ и перемешивают в течение 20 мин. Посредством висячего пористого найлонового мешочка, наполненного амберлитом 1 ВЛ 410 ОН - , значение рН поддерживают на 3,0. Затем отфильтровывают дауэкс (фракция дауэкса 11) и удаляют фильтрат (2,6 л, 27000 ед. инг, сахаразы/л). Каждую из фракций 1 и 11 дауэкса 3 раза промывают 75 в/е-ным ацетоном при рН 3,5 и затем три раза десорбируют 100 мл (фракция 1 дауэкса) или 150 мл (фракция 11 дауэкса) О,б/а -ным раствором аммиака. При первой десорбции, при которой количество аммиака было недостаточным для нейтрализации дауэксной смолы, значение рН доводят до 9 П р и м е р 11. 200 г описанного в примере 1 препарата растворяют в 940 мл дистиллированной воды и в 60 мл конц. серной кислоты и в течение 4 час нагревают до кипения с обратным холодильником (внутренняя температура 98 - 100 С; температура масляной бани 140 С). К охлажденному черно-коричневому раствору добавляют 10 г активного угля (фирмы Мерк Мо 2186) и перемешивают в течение 1 часа. Затем активный уголь отсасывают, промывают водой и фильтрат примерно 250 мл 10 н. КОН доводят до рН 7 - 8, Раствор в течение часа перемешивают с 50 г активированного угля, Уголь отсасывают, промывают 2 л воды и фильтрат отделяют. Для десорбции 14посредством конц. ХНз, Трп элюата фракций 1 и 11 дауэкса объединяют и упаривают досуха, растворяют в 50 мл воды, соляной кислотой доводят до значения рН 3 - 4 и добавляют 5 50 мл метанола. Растворы при перемешиваниппо каплям добавляют к 1,5 л абсолютного ацетона, выпавший осадок фильтруют на путче и 3 раза промывают ацетоном и 1 раз эфиром. Сушат в вакууме. Выход: фракция 1 10 65 г, 25000 ед. пнгибитора сахаразы/г. Фракция 11 12,3 г, 36000 ед. пнгибитора сахаразы/г.Фракции 1 и 111 наг ингибито 1 зные асомпоненты преимущественно содержат производ ное аминосахаров с )г=2 наряду с небольшимколичеством следующих высших гомологов (гг=З).В таблице приведены данные о полученныхсоединениях,20 уголь в течение ночи дигерируют 2 л 30 а/е-ногоспирта. Затем отсасывают уголь и спиртовой раствор упаривают. Остаток 6,2 г. Сырой продукт (6,2 г) растворяют в 500 мл воды и в течение часа осторожно перемешивают с 30 г амберлита 1 К 120 (Н+-форма) . Катионпт фильтруют и промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции фильтрата. Затем ионит в течение ночи перемешивают с 15 мл 25 а/а-ного аммиака в 1000 мл воды, отделяют 30 и удаляют. Фильтрат упаривают, Остаток 3,7 г.Для дальнейшей очистки проводят хрома.тографию на целлюлозе. 4,5 г десорбирован.ного с ионита материала наносят на наполненную целлюлозой колонку длиной 1 м ишириной 2,5 см. В качестве элюента применяют систему этанол/вода 5: 1, для элюирования производного амипосахаров с п=1 применяют этанол/вода 3:1. При скорости 20 капель в минуту собирают фракции по 14 мл, Отдельные фракции проверяют тонкослойной хроматографией,После упаривания фракции 47 - 85 дают 1,6 г коричневатого производного амипосахаров с и=1. Окрашенные примеси количественно не имеют никакого значения. Производное аминосахаров с и= получают как бесцветную смолу, если очистку проводят с сильнокислым повитом не периодическим процессом, а на колонке.П р и м е р 12, 200 г описанного в примере 1 препарата растворяют в 940 мл дистиллированной воды и 60 мл конц. Н 504 и в течение 1/4 часа нагревают до кипения с обратным холодильником (внутренняя температура 98 - 100 С; температура масляной бани 140 С), К охлажденному черпо-коричневому раствору добавляют 10 г актпвированного угля (фирмы Мерк, Хо 2186) и перемешивают в течение часа. Затем отсасывают актпвированный уголь, промывают водой и фильтрат 250 мл 10 н. КОН доводят до рН 7 - 8. Раствор в течение часа перемешивают с 50 г активированного угля. Уголь отсасывают, промывают 2 л воды и фильтрат упаривают. Для десорбцпи уголь в течение ночи дигерируют 2 л 30%-ного спирта. Затем уголь фильтруют, и спиртовой раствор упаривают. Остаток 8,0 г.Остаток растворяют в 15 мл1 О и наносят на наполненную 50 г амберлита 1 Й 120 (Н+-форма) колонку (высота 20 см, диаметр 2,4 см). Подают со скоростью 3 капли в 1 мип и промывают водой (12 капель/мин) до удаления всех основных компонентов. Затем основные продукты 0,5/-ным аммиаком удаляют с колонки элюированием (12 капель мин) и водный раствор упаривают досуха. Остаток 4,1 г,2 г этого остатка растворяют в небольшом количестве воды и наносят на наполненную Ьерйасех 6-15 колонку (высота 200 см, диаметр 3,0 см), Элюируют водой. При скорости 8 мл/час собирают фракции по 2 мл, Отдельные фракции исследуют тонкослойной хроматографией. Фракции 85 - 94 дают 280 мг производного аминосахаров с а=2 со специфической активностью 50 000 ед, ипг. сахаразы/г.Пример 13. 2 г препарата, описанного в примере 1, в 60 мл 20 мМ натрий-глицерофосфатного буфера с рН 6,9 и 1 мМ СаС, прп постоянном перемешивании в течение 120 час при 37 С инкубируют 1 г а-амилазы из Аврегр 1 пв зрес. (фирмы Серва, М 13418), затем в течение 5 мин нагревают до 100 С и нерастворимые части удаляют центрифугированием при 4000 об/мин. После лиофилизации раствора получают 1,9 г продукта с 350 ед. инг, сахаразы/г и 2 10 ед, инг. амилазы/г. Если этот продукт исследуют тонкослойпой хроматографией или посредством окраски ингпбиции са 1 О 15 2 О 25 30 35 4 О 45 50 55 60 65 харазы согласно примеру 2, то оказывается, что в качестве ингибиторно-активных соединений в основном получают производные аминосахаров с и=1, 2 и 3.Пр им е р 14, Если 2 г препарата, описанного в примере 1, в 30 мл 20 мМ ацетатного буфера с рН 4,8 при постоянном перемешивавии в течение 120 час при 37 С инкубируют 1,25 мг р-амилазы из сладкого картофеля (фирмы Берингер 15471), затем в течение 5 мин нагревают до 100 С и нерастворимые части удаляют центрифугированием при 4000 об/мин, то после лиофилизации раствора получают 1,5 г продукта с 1800 ед. инг. саха- разы/г и 3,8 106 ед. инг. амилазы/г.Если этот продукт исследуют тонкослойной хроматографией или посредством окраски ингибиции сахаразы согласно примеру 2, то оказывается, что в качестве ингибиторно-активных соединений в основном получают производные аминосахаров с п=2 и 3.П р и м е р 15, Если колбу Эрленмейера емкостью 200 мл с 25 мл питательной жидкости, состоящей из 0,1/о К 2 НРО 4, 0,2/в (ХН 4)804, 0,057 о Мд 804 0,05/о КС 1, 0017 о Ге 504 2/о препарата, описанного в примере 1, засевают суспензией спор штамма Лзр. %дег АТСС 11304 и при 28 С инкубируют на качалке, то через б дней снижается титр с 210 000 до 53000 ед. инг. амилазы/мл и через 10 дней до 21 300 ед. инг. амилазы/мл. Одновременно содержание ед. инг. сахаразы/мл с 7,0 повышается до 72 ед. ингибитора сахаразы/мл.20 мл раствора, в течение 10 дней инкубированного суспензией спор, для отделения мицелия в течение 30 мин центрифугируют при 3000 об/мин, Из 15 мл остатка 72000 ед. инг. сахаразы/л) при 30-минутном перемешиванпи с 2 г амберлита 1 КС 50 Н+ и 1 г амберлита 1 КЛ 140 ОН - удаляют соли (электропроводность менее 2 мсим). Раствор фильтруют и фильтрат с 5 мл/час пропускают через эквилибрированную дауэксом Н+ в 0,001 н. НС 1 колонку (диаметр 1 смХ 10 см), затем промывают 200 мл 0,001 н. НС 1, Для десорбции колонку промывают О,б-ным раствором аммиака (10 мл/час) и собирают 5 мл фракции. Фракции, оказывающие ингибирующее на сахаразу действие, упаривают до 2 мл и добавляют 2 мл метанола. Этот раствор доводят до рН 3 - 4 и для осаждения по каплям добавляют к 100 мл ацетона. Осадок фильтруют на нутче, промывают ацетоном и простым эфиром и сушат в вакууме, Выход 26 мг с 28000 ед. инг, сахаразы/г из производных аминосахаров с и= 2 и 3. Чистое производное аминосахаров с а=2 получают из этого продукта, как описано в примере 9, гель в фильтраци через колонку биогеля Р. Получают 7 мг производного аминосахаров с п=2 с 60000 ед. инг. сахаразы/г.П р и м е р 16, 2 л культурального фильтрата, получаемого из ферментационного раствора согласно примеру 6 удалением мицелия центрифугированием при 13 000 об/мин, име 5622022 д ЗЭ 35 4 О 45 50 55 ю 65 17ющего активность 13000 ед. ицг. сахаразы/г. для снижения содер)кания соли (электропроводность культурального фильтрата примерно 10 мсим) в течение часа перемешивают с 500 г смеси из 2,5 части амберлита 1 КС(Н+-форма) и 1 части амберлита 1 КА(ОН-форма), фильтруют, упаривают до 100 мл и для удаления нерастворимых частей в течение 15 мин центрифугируют при 20000 ед/мин. Остаток доводят до 100 мл его электропроводность 3,5 мсим) и для дальнейшей очистки наносят на колонку (55 Х 400 мм) с Р-целлюлозой (фирмы Серва М 45130; полученный известными способами и эквилибрированный в 5 мМ аммонийфосфатного буфера, рН 5,5). В качестве растворителя используют указанный фосфатный буфер (скорость 90 мл/час) и собирают фракции по 18 мл,Фракции алюата проверяют на содержание углеводов (антроновая проба) и на ингибирующие сахаразу компоненты (пробой на ингибицию сахаразы), затем фракции, которые согласно антроновой пробе почти не содержат углеводов и одновременно согласно пробе с сахаразой оказались особенно активными (фракции 60 - 170), объединяют, упаривают до 150 мл и фильтруют через колонку (50 ХЗОО мм) с амберлитом 1 КА(НСОз - - форма). Для лучшего контроля деионизации элюат собирают по фракциям (10 мл на фракцию в 20 мин) и проверяют на углеводы (посредством антроновой пробы; почти отрицательно), на фосфат (посредством реактива аскорбиновой кислоты - молибдата: почти отрицательно) и на ингибицию сахаразы (посредством ферментативной пробы). Ингибиторно-активные фракции (3 - 30) собирают, концентрируют и лиофилизируют, повторно растворяют и лиофилизируют, причем получают 280 мг сырого ингибитора.Для дальнейшей очистки сырой ингибитор согласно примеру 6 фракционируют через биогель Р. Из фракций, содержащих чистое производное аминосахаров с гг=1, после лиофилизации получают 30 мг продукта с 0,3 10 ед. инг, амилазы/г и 35000 ед. инг. сахаразы/г.П р и м е р 17. Для получения производных аминосахаров с гг=5 - 7 исходят, например, из описанного в прмере 1 препарата.Для этого 30 г препарата согласно примеру 1 растворяют в 250 мл Н,О. Электропроводность этого раствора составляет 10 мсим, рН 5,5. Для обессоливания к раствору добавляют 60 г амберлита 1 КС 50 Н+ (слабокислый катионит, который только минимально связывает производные аминосахаров из водного раствора) и 20 г амберлита 1 КА 410 ОН - и перемешивают в течение 20 мин. Фильтрат (электропроводность 0,5 мсим, рН 3,5) посредством 1 н. НС 1 доводят до значения р 1-1 3,0 (электропроводность 0,6 мсим). Этот раствор с 42 мл/час пропускают через наполненную дауэксом 50%+) (Н+) колонку (диаметр 2,5 см, высота 40 см, эквилибрировано в 0,001 и, ПС) ц затем промывают 2 л 0,001 н. НС. После промьви колонки элюируют 1,20/о-ным водным аммиаком ц собирают 10 мл фракции. Ицгибцторцо-активные фракции Объединяют, аммис. )даляют В Васууме и зателг раствор упариваот до 30 мл. Осаждают прикапыванцем в 600 мл спирта, осадок отфильтровывают ца путче ц после промывки спиртом и эфиром сушат в вакууме. Выход 4,4 г с 26,5 10" сд. Ицг. амилазы/г,По 0,5 г для токой очистки, согласно примеру 9, наносят ца колонну с биогелсм Ри проявляют. Фракции, которые согласно тонкослойцой хрол атогрдфии (Окраска ицгибиции амилазы) содержат производные алгццосахаров с а=5 - 7, объединяют, упаривают в вакууме и Осаждают указаццьгм спосооом спиртом, Выход из 0,5 г сырого продукта: 0,2 г производных амицосахаров с гг= 5 - 7 с 30 10 ед, иьг. амилазы/г ц 2500 сд. ицг. сахаразы/г. П р и м е р 19 (пример кислой десорбции предлагаемых соединений) .Колонку диаметром 1,5 см заполняют 30 г сырого дауэкса 50 б 4 (Н+) 200 - 400 меш в 0,001 н. НС 1. Затем примерно в течение часа через колонку пропускают смешанный элюат (400000 ед. ицг, сахаразы/л, рН 2,5, 600/о-ного ацетона), полученный согласно примеру 10, и затем промывают 500 мл 0,001 ц. НС 1. В этих условиях элюируется только минимальная активность. Затем десорбируют 0,0125 н. НС 1, причем регистрируют электропроводность элюата колонки. Кроме того, исследуют на содержание ед, шгг. сахаразы элюата. Активные фракции 74 - 100 объсдИняют и нейтрализуют добавкой амберлита 1 КА 410 ОН - , затем упаривают до 5 мл, добавляют 5 мл метанола ц осаждают добавкой по каплям к 200 мл ацетона. После промывки ацетоном и эфиром сушат в вакууме.Выход 1 г производного аминосахаров с гг=2 с 65 000 ед. Ицг. сахаразы/г. Из активных предварительных фракций получают производные амицосахара с гг=З и гг =4.Этот способ кислой десорбции в протпвоположцость к основной десорбции позволяет фракциоцировать гомологические производные амицосахаров,Индивидуальность производного аминосахара 1, где К - глюкоза, а гг=1 - 7 подтверждена данными тонкослойцой хроматографии, гг - 1 газовой хроматографией его триметилсилильцого производного, гг=1 - 2 - углом вращения.Строение процзводцого аминосахара 1, где К - глюкоза, а гг =1 - 2 подтверждено ИК-спектрами, Я.ЧР-спектрал 111 частично дейтерироваццых производных, масс-спектрами ацетилироваццых и метцлированцых производных.Строение высших гомологов подтверждено продуктами деградации.