Способ получения антибактериального вещества — SU 618053 (original) (raw)
Союз Советских Социалистических 3(45) Дата опубликования описания 25,07,78 2Государственный номнтет Совета 1 йнннстроа СССР по делам нзобретеннй н открытнйИностранцыДжон Генри Эдвард Джеймс Мартин, Гомер Дэвид Треснери Джон Н орман П ортер(72) Авторы изобретения Иностранная фирма(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГОВЕШЕСТВА Изобретение относится к способу получения антибактериального вещества, образующегося при выращивании культуры микроорганизма НОСаЧ 31 а бр. ИкК), % 5646.Известны способы получения антибакте- б риальных веществ путем выращивания продуцентов из различных культур микроорганизмов в питательной среде, содержащей ассимилируемые источники углерода, азота и неорганические соли, с последующим О выделением целевого продукта общеизвестными приемами 11. Целью изобретения является получениенового эффективного антибактериального 1 Звещества, расширяющего арсенал известных антибактериальных средств,Поставленная цель достигается тем,что культуру микроорганизма йОСдр 3дбН 3 Ч 1 Мо 5646 выращивают в воднойпитательной среде, содержащей ассимилируемые источники углерода, азота инеорганические соли, в аэробных условияхв течение 45-240 ч с последующимвыделением целевого продукта с помощью Ж ионообменной колонки в виде смеси илиотдельных фракций.Целевой продукт выделяют в видеальфа-, бета- или гамма-активных фракций,Новые антибактериальные средстваобозначены: ВМ 123 сХ ВМ 123 ф иВМ 123 . Штамм-продуцент новогоантибиотика выделен из образца почвы вОдеяла (Айова) и хранится в коллекциикультур "Американ цианамид компани,Пирл Ривер, Нью-Йорк, под номеромВМ 123, )Кизнеспособная культура нового микроорганизма хранится в СИ 11 ОтЕСоИеебои дЬот акопу, 1 то 1 Иет тт 36 бха 6 оп Яеьеасй апд ЪечеРОяееит. Здымам,11 п 1 ео богатее Зераг 1 аптеи 1а 1 Ятчсц Иц е, 7 еог а,Иио т ь,под номером 5646,Культуральные признаки штамма приведены в табл, 1,физиологические признаки штамма приведены в табл. 2.Данные об утилизации штаммом источников углерода приведены в табл.3,Вещества можно вводить в различныефармацевтические формы, например, винъекционные рестворы, таблетки, капсулы, пилюли и т.п. для непосредственного или поддерживающего действия в сочетании с соответствующими носителямиили наполнителями.П р и м е р 1, Приготовление инокулума.Типичную среду для выращивания первичного инокулума приготавливают но следующей рецептуре, г:Мясной экстракт 3Бак тотрип тон 5Дрожжевой экстракт 5Крахмал 24Декстроза 1В ода до 100 (мл)Доводят рН едким натром до 7,0,Промытые или снятые споры с косого агарайСОРЙО ВР.ОВ5646 используют для инокуляции двух матрацевемкостью 500 мл в которых находитсяпо 100 мл вышеуказанной стерильнойсреды. Матрацы помещают на ротецион 25ную качалку и энергично взбалтывают48 ч при 28 С, Образовавшийся иноокулум переносят в 5-тигалонкый ферментер (стеклянный) с 12 л стерильнойсреды. Аэрируют стерильным воздухом48 ч, после чего содержимое используют30для засева 300-литрового танка-ферментера со 150 л стерильной среды, Массуинокулума аэрируют стерильным воздухом из расчета 1 л воздуха на 1 лмассы в минуту, подаваемым в нижнюючасть ферментера, без механическогодополнительного перемешивания. Массуовыдерживают при 28 С, В качествепротивовспениваюшего средства исползуют лярд.40После 53 ч выращивания массу инокулума используют для засева 2000-литрового ферментера со 1350 л стерильной ферментационной среды.П р и м е р 2, ФерментацияНОСОИа8.ЮБ) 0 5646 на среде, благоприятствующей продуцированию БМ 123 Ж,Приготавливают ферментационнуюсреду следующего состава,г;Бактоцептон 10,050:.Г:кс тр оза 100,0М еласса 20,0Железо-амм онийлк; . они окислый 0,1Карбснат кальция 1,055В ода До 1000 (мл)Ферментационную среду стерилизуют60 мин при 120 оС паром при давлении8 кгмрИ среды после стерилизацииЯ 2067, 1350 л стерильной среды в2000-литровом танке-ферментере инокулируют 150 л инокулума, полученногоописанным в примере 1 способом. Ферменотацию ведут при 28 Сиспользуя в качестве пеногасителя лярд. Аэрацию ведутиз расчета 0,6;0,7 л стерильного воздуха на 1 л массы в минуту. Массу перемешивают при 50 об/мин, Ферментацию ведутМЗО ч,П р и м е р 3, Выделение ВМ 123 Ж,Ферментацию ведут как описано выше.30 л ферментационной массы с рН 7,7отфильтровывают, используя в качествефильтрующего вспомогательного средстве300 г диатомовой земли "пирог" промывают водой, объединяют фильтрат с:промывной жидкостью (31 л) и солянойкислотой доводят рН до 6,5, вносят62 г фтористого натра, и смесь перемешивают в течение часа, Образовавшуюсясуспензию фильтруют, используя диатомовую землю в качестве фильтрующего средства, и получают 31 л фильтрата, Фильтрат пропускают через колонку с 1 ЯС(38 ) (50-100 меш) с объемомслоя 1 л. ВМ 123 д элюируют, пропускаяО,З н. серную кислоту через колонку исобирая фракции объемом по 500 мл.Фракции 1-7, содержащие активный компонент, объединяют и едким барием доводят рН до .7,2, Сульфат барияочфильтровывают и получают прозрачныйфильтрат. Его пропускают в течение ночичерез колонку с 1 Я С 50 (Н ) с объемом слоя в 650 мл, Колонку промывают4 л воды и элюируют действующее начало 0,3 н, серной кислотой. Активныефракции (1-7) обрабатывают едким барием для доведения рН до 70 фильтруют,получают 2,9 л прозрачного фильтрата,упаривают под вакуумом до 75 мл дляпоследующей хроматографии на угле,1 л гранулированной Дарко С(20-40 меш) суспендируют в воде, переносят в стеклянную колонку и оставляютотстояться. Удаляют избыток воды и вколонку медленно пропускают 75 мл концентрата, Загруженную колонку промывают4 л воды и роявяю 3,5 л 50%-ноговодного метанола, собирая фракции по50 мл, фракции 18-68 упаривают до водной фазы под вакуумом, лиофилизируют,получают 64 г белого твердого веществва ВМ 123 а;, Колонку с углем проявляют 50%-ным подкисленным воднымметанолом (рН 1,8, при помощи сернойкислоты) и получают дополнительно 16фракций, Объединяют подкисленныефракции, уларивают под вакуумом до водной фазы, доводят рН едким барием до7,2, фильтруют, лиофилизируют, получаютеще 1,5 г ВМ 123 сб,Обе порции твердого, вещества представляют, по данным тонкослойной хроматографии, смесь Ж 1 и об 2. ЭтотВМ 123 а; сушат 16 ч в сушилке бдергальдена над кипящим этанолом, затем производят микроанализ.ВМ 123 б не.имеет четкой точкиплавления, постепенное разложение иачи 1 Оонается около 200 С. Микроанализ,%:С 33,89; Н 5,71; И 11,88 (непосредственно 35,40), зольность О. ВМ 123 йпропускает свет в области 220-340 нм35в 90%-ном метаноле при концентрации200 мкг/мл,% 1) =+52 (с 1,00 в Н О),ВМ 123 а обнаруживает характернуюабсорбцию в инфракрасной области спектра при длине волны, см 1: 780, 815,950, 1050, 1110, 1250, 1340, 1395,1560, 1670, 1705, 2950 3330,П р и м е р 4, Ферментация с применениемМОСОРЙО 8.9 ЯИЬМф 5646 и среды,обеспечивающейродуцирование ВМ 123 с(и ВМ 123,Приготааливают ферментационную среду следующего состава, г:Декстроза 10,0 30Мясной экстракт 4 0Бактопептон 4,0Хлористый натрий 2,5Дрожжевой экстракт 1,0Вода До 1000 (мл):3Едким натром доводят рН до 7,0.Ферментациапую среду стерилизуют60 мин при 120 С паром под давлением8 кг/м", рН стерилизованной среды6,7. 1350 л стерильной среды в 4 о2000-литровом танке-ферментере инокулируют 150 л инокулума. Ферментациюоведут при 28 С, используя лярд в качестве противовспенивающего средства,Аэрацию ведут из расчета 0,4 л воздуха на 1 л среды в минуту, Массу перемешивают при 50 об/мин. Ферментациюведут 85 ч,П р и м е р 5, Выделение ВМ 123 фи ВМ 123 ,501350 л ферментационной массы, попученной описанным в примере 4 способом,фильтруют, используя 1% диатомовойземли в качестве фильтрующего средства,пира" промывают 50 .л воды и отста- Ыивают. Объединенные фильтрат и промывную жидкость пропускают через 10-литровый слой 1 ЧС 50 (Ыи) под действием собственной тяжести со скоростью потока 330 мл/мин, Колонку промываютзатем 30 л воды. Активные компонентыэлюируют иэ колонки, используя для этого170 л 0,3 н. серной кислоты. Элюат собирают в две порции. Первая порция содержит элюат с рИ от 7,0 до 5,0, Первые45 л отстаивают из-за высокого содержания соли. Вторая порция (120 л) имеетрН 1,4, Эту кислую порцию доводят едким барием до рН 6,0, отфильтровываютобразовавшийся сульфат бария, используя при этом 1 кг диатомовой земли вкачестве фильтрующего средства "пирог"промывают 5 л воды, фильтрат вместес промывной жидкостью упаривают подвакуумом до объема 2 л. Концентооатнагревают на паровой бане до 50 С ивносят в горячий раствор соли Рейнеке(150 г в 1500 мл воды при 75 С),Горячий раствор оставляют на 48 ч прикомнатной температуре, затем фильтруюти получают твердое вещество краснолилового цвета, которое промывают 600 млводы, Влажное твердое вещество перемешивают с 2 л воды и 5 л бутанола, доводятрН до 1,5 при помощи 0,25 н, серной кислоты, Смесь отфильтровывают и водную фазу фильтрата обрабатывают твердымедким барием, доводя рН до 6,5.Смесьотфильтровывают и упаривают под вакуумом, доводя объем до 350 мл, Концентрат пропускают через колонку (объемом 100 мл) с Дауэкс 1-х 4 (С 1 ),лиофилизируют и получают 50 г продукта.250 г порошкообраэной целлюлозы смешивают с 200 мл верхней фазы, полученной при смешении 90%-ного фенола, хлороформа, пиридина, уксусной кислоты, воды (1500:300:45:45;750 по объему).Затем через верхнюю часть колонкизагружают смесь 10 г лиофилизированного продукта в 16 мл верхней фазы и 20 гувлажненной порошкообразной целлюлозы.Колонку проявляют, используя воздухпод давлением 0,2 кг/м из резервУара,присоединенного к верхней части стеклянной колонки, Собирают 75 фракций по25 мл,Активность устанавливают биоавтографией смоченных бумажньи кружков, вы- .сушенных на воздухе и промытых эфиром, до нанесения на большую агаровую пластину засеянную К.РиВОФО ФЩЬ штамм АЗ, Наблюдаются две отдельные активные полосы. Одна из них (ВМ 123(у) состоит из фракции 3-18, а вторая (ВМ 123 3 ) - из фракций 31 - 52. Объединяют фракции 3-18, добавляют 1400 мл )хлороформа, получают двухфазную.систе25 му. После разделения верхнюю воднуюфазу (рН 4,5) дважды экстрагируют равным объемом эфира для удаления остаточного фенола, рН водной фазы доводятдо 6;5 при помощи 1 к 45 (ОН ), лиофилизируют и получают 1,62 г ВМ 123,Объединяют. фракции 31-52, обрабатывают аналогично и получают 1,05 гВМ 123 Ъ.1 г ВМ 123перемешивают 15 минс 20 мл абсолютного метанола, суспензию отфильтровывают, получают 305 мгтвердого вещества, фильтруют, к фильтрату приливают 60 мл эфира, получаютсуспензию белого хлопьевидного материала в эфире-метаноле, отфильтровывают,15получают белое твердое вешество и беловатый фильтрат, Твердое веществопромывают на воронке Бюхнера эфироми сушат на воздухе, получают 602 мгВМ 123 , сушат под вакуумом в су 20щильном аппарате Абдергальдена надкипящим этанолом 16 ч,ВМ 123не имеет четкой точкиплавления, постепенное разложение наочинается около 200 С,Микроанализ,%; С 46,13; Н 6,65;Й 17,0 (непосред, - 24,96); зола0,90,Соединение обнаруживает в 90%-номметаноле максимум абсорбции в УФ-об 30Ф/ласти при,286 нм (Е, =200).а 1 р =+ 53;8 (С=1,004 в НО)ВМ 123 обнаруживает характернуюабсорбцию в инфракрасной области спектра при длине волны, см: 765, 870,,5980, 1045, 1112, 1175, 1230, 1340,1400, 1465, 1510, 1570, 1610 1660,2190, 3333,670 мг ВМ 123 3 перемешивают с4012 мл метанола в течение 15 мин, отфильтровывают, в фильтрат приливают36 мл эфира, получают белый осадок.Его собирают на фильтре, промываютэфиром, сушат на воздухе, получают466 мг ВМ 123 ф, который сушат подвакуумом над кипящим этанолом втечение 4 ч (до микроанализа),ВМ 1235 не имеет четкой точки плавления, но начинает постепенно разлагаться около 200 С,50Микроанализ,%: С 47,53; Н 7,39;16,54; зольность 1,04, В 98%-номметаноле он обнаруживает максимумУф-абсорбции при 286 им при Е=200,Положение максимума не изменяется и55зависимости от рН.6 р=+53,2 (С= 1,250 в НО).ВМ 123обнаруживает характернуюабсорбцию в инфракрасной области спектр апри длине волны, см : 826, 870,922, 980, 1035, 1105, 1170, 1220,1340, 1390, 1510, 1560, . 1600)1670, 2950, 3080, 3350,П р и м е р 6. Распределение на бумаге и тонкослойная хроматографияактивных компонентов,Антибактериальные средства можноразличить методом хроматографии набумаге. Для этой цели на полоски ватманской бумаги %1 наносят водныйили метанольный раствор веществ иуравновешивают 1-2 ч в присутствии верхнейи нижней фаз, Полосы проявляют с нижней (органической) фазы, полученной присмешении 90 оо-ного фенола; м-крезола;уксусной кислоты, пиридина, воды (100::25:444:75 по объему). Полоски удаляютиз камеры, сушат на воздухе 1-2 ч, промывают эфиром для удаления остаточногофенола и подвергают биоавтографии набольших пластинах агара, засеянныхК ИЕЦФОИ(аь.для ВМ 123 А -0,20, 0,47;ВМ 123 Ь -0,62, 0,71; ВМ 123 -0,88.06 и ф -компоненты представляют собой смесь двух антибиотиков. ф компонент состоит из главного антибиотика(=0,62), названного ВМ 123 ф 1 и меньщего компонента ВМ 123 (К =0,71).Наиболее полярный компонент ВМ 123 йД =0,20) назван ВМ 123 Ж 1, а менееполярный ( К =0,47) назван ВМ 123 Ф.ВМ 123 Ж разделяется на два компонента методом, основанным на тонкослойной хроматографии, на Полиграм Цел Щ254 с тонкослойной целлюлозой, выпускаемой фирмой Бринкманн Инструментслимитед", Нью-йорк, Тонкослойныепластины с пятнами раствора веществапроявляют водой, содержащей 1% тринатрийцитрата. Зоны проявляют автографически на агаровых пластинах, какописано выше, в результате две зо-ны; ВМ 123 А с Й =0,90 и ВМ 1230с Я =0,65.формула изобретения1, Способ получения антибактериального вещества, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что культуру микроорганизма 80 сдР Бр. КОРЬ Мо 5646 выращивают в водной питательной среде, содержащей ассимилируемые источники углерода, азота и неорганические соли, в аэробных условиях в течение 42-240 ч с последующим выделением целевого про дукта с помощью ионообменной колонки в виде смеси или отдельных фракций,2, Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, целевой продукт . выделяют в виде альфа, бета или гамма-активных фракций,Источники информации, принятые вовнимание при экспертизе:1, Патент США Мо 3597325,кл. 195-96, 1971, Составитель Л, МураяРедактор Н, Хубларова ТехредА. Богдан Корректор Н, ТупицаЗаказ 4131 Тираж 568 Подписное11 НИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4618053 Таблица 1 Умереный Беловатыйсветлый Агар с джевымакс тракт чичныйд е) От бесцветного до желтовато-зеленого и- Незна- В оздушныйрес- читель- мицелий ный отсутствуе еяера рхн или овятся олив- овэ-зелеными БеловатыйАгар с аспа- Уме рагиновой ный декстроэой тарныйЬс) о же Беловатый,светлый Рыжевато- коричневый (4 ф с) Бенедик СредаБеннета Беловатый(следы) ж Сл цветиь о-ал отс т Следы Агар с овсяными хлопьями Кустаре ж Чашека Следы й Агар, с картофельной дексрсти 3 е) значильный ар с томатной пастой и овсяной мукой Ко аг Незначи- тельный То же о Неорг чески ли-кр рен- Бел оважсве алый Воздушныймицелий отсутствует ерблюжьейерсти31 е) Темные поверхности в субстратемицелия Коремия на поериферическоверхнос тиолоний стаСлегка морщинистая поверхность Обильнаякоремияповерхиосмицелия легка мориннстая поерхность618053 Продолжение табл, 1 Среда Рост Цвет воздушного мицелия Приме чание Следы Рисовый. агар Агар Вайн- , умеренштейна ный оП р и м е ч а н и е: 1, Инкубация 14 дней, 32 С2. Растворимые пигменты не образует. Таблица 2 значи- Нльный елатина ижае Хорош То же ульон с органическим нитраХороши осстанавливает траты в нитри 4 То же ж Пептоновый агас железом 4-28 Меланинов Хороши пигмент не образуется пурное молоХорош о 1 е 7 йнатр ере н йрожжевой экстракт, агар +.хлористый натри (4,710 и 13%- ный) Цвет культуры с обратной стороны От бесцветного до желтоватого Отсутствие лепт низации или ств жив ания носим остьхлористомуию 4%, - 7%-Манн О СалицинО -М олибиоэа-Раффиноза амноз Мальтоза СахарозаД-Трегалоз сил оза 3Декстроз трицательный контроль 3 - хорошее испол 1 - слабое, 0 - н 45 ными спиралями, Извилистые элементынеравномерно сегментированы на короткие эллиптические - цилиндрические секции, легко расчленякициеся, Спиральныеконечные части сегментированы менее заок 5 О метко, Размер сегмеитоа обычно в интервале 0,8-1,7 ммк х 0,3-0,5 ммк,в среднем 0,4 ммк х 1,2 ммк,Эксперименты с предяарительнымвыделением тонкослойной и бумажной55 хроматографией показали, что в процессеаэробной ферментапии ФОСОРАа вр. ЯКИМ 5646 продуйируюзея по крайней мере три антибиотика; ВМ 123 а., ВМ 123/Ьи ВМ 123 ,. Изучение питательных 4Химический с остав. Микроорганизм относится к клеточной оболочке. типа Я т.е. содержит меэо 2,6-диаминопимелиновую кислоту и по сахаридам относится к типу А, т.е, содержит арабиноэу и галактоэу. Метилированный экстракт клет обнаруживает при газовой хроматографии картину жирных кислот, аналогичную продуцируемой 9 ОСа Ыа айЕЮдеа МСС3308,Микроморфология. Воздушный мицелий вырастает иэ иицелиального субстрата в виде слабораэветвленных умеренно длинныхизвилистых элементов, обычно заканчивакнцихся удлиненными примитивование, 2 - удовлетворительноеспольэуется,сред выявило наличие двух типов питательных смесей: типа гамма, продуцирующей, в основном, ВМ 123с небольшими количествами ВМ 123 ф и ВМ 123 Ж,и типа альфа, продуцирующей в основномВМ 123 Ж, Процесс ферментации идет,главным образом, в направлении избирательного продуцирования ВМ 123альфа.Выращивание МОСОРЙи б.МЮЬ 14 5646можно проводить в раапичных жидкихкультуральных средах. Среда, пригоднаядля продуцирования новых антибиотиков,включает; ассимилируемые источникиуглерода, такие как крахмал, сахар, меласса, глицерин и т.п; ассимилируемые15источники азота, такие как протеин,гидролизаты протеина, полипептиды, аминокислоты, замочная жидкость ржи (кукурузы) и т.п.; и неорганические анионыи катионы, такие как калий, натрий, кань 20ций, сульфаты, фосфаж, хлориды и т.п.Микроэлементы-бор, молибден, медь ит, п. вносятся в виде следов или примесей других компонентов смеси. Процесс ведут при аэрировании (в танках и2баллонах) стерильным воздухом черезмассу или на поверхности ферментативнойсреды, Необходимо также механическоеперемешивание в танках. При надобности можно внести противовспенивающеесредство, например лярд. Дпя получения ВМ 123 ю инокулум ЦоСОР 31 О В.ЩЯЬ М. 5646 для колб-качалок получают инокуляцией 100 млстерильной жидкой среды следующегосостава, г:Мясной экстракт 3Бактотриптон 5Дрожжевой экстракт 5Крахмал 24Декстроза 1В ода до 1000 (мл)РН среды доводят едким натром до 7,0,Колбы или матрацы (емкостью 500 мл)45инкубируют при 25- 29 С предпочтительоно 28 С, и энергично перемешивают наротационной качалке 30-48 ч, Отбираютпорции по 100 мл прививочного материа 50ла и инокулируют 1 л и 12 л той же средыв 2-х и 20-литровых стеклянных ферментерах. Инокулированную смесь аэрируют стерильным воздухом в процессероста в течение 40-55 ч, Эти партии55инокулума используют для и:окуляциитанков-ферментеров,Для продуцирования ВМ 123 х в танке-ферментере используют среду следующего состава, г; Бактопептон 10,0Декс тр оза 10,0Меласса 20,0Железо-аммоний лимонно-кислый 0,1Карбонат кальция 1,0Вода До 1000(мл)Танк инокулируют 3-10% вышеполученного инокулума, Аэрацию проводят из расчета 0,2-0,8 л стерильного воздуха на 1 л бульона в минуту, и ферментационную смесь перемешивают мешалкой при 50-200 об/мин, Температуру пододерживают 25-29 С,. предпочтительно 28 С. Ферментация длится 180-240 ч,По окончании ферментации отфильтровывают ферментационную массу, содержащую ВМ 123 Ж, предпочтительно при помощи диатомовой земли или других обычных фильтровальных вспомогательных средств, Обычно мицелиальный "пирог" промывают водой и объединяют фильтрат с промывной жидкостью, Объем фильтрата составляет в среднем 30 л, Доводят рН до 6,5, добавляют фтористый натрий, и смесь перемешивают около часа. Образовавшуюся суспензию фильтруют, например через диатомовую землю. Фильтрат перколируют через колонку с 1 КС - 50 (Каф) (50-100 меш) со сла бокислой смолой (выпускаемой фирмой "Ром и Хаас", Филадельфия, Пенсильвания) с объемом слоя в 1 л. Колонку со смолой промывают 4 л воды.ВМ 1234 элюируют, пропуская через колонку 0,3 н, серную кислоту. Элюат собирают во фракции общим объемом 500 мл, фракции 1-7, содержащие действующее начало ВМ 123 к объединяют и доводят едким барием до рН 7,2, Образовавшийся сульфат бария отфильтровывают, получают прозрачный фильтрат, Этот фильтрат пропскают через колонку с П,С - 50 (Н ) с объемом слоя в 650 мл, Колонху промывают водой и элюируют по вышеописанному методу 0,3 н. серной кислотой, Активные фракции (1-7) также доводят - при помощи едкого бария - до рН 7,0 и отфильтровывают, получают прозрачный фильтрат, Этот раствор упаривают под вакуумом для последующей хроматографии на угле. Гранулированный Дарко С(20-40 меш) суспендируют в воде, переносят в стеклянную колонку и отстаивают, сливают избыток воды и концентрат ВМ 123 с медленно пропускают в колонку. Загруженную колонку промывают водой и проявляют 50%-ным водным метанолом, собирая фракции по 50 мл, Объединяют активные фракции(18-68)(водный слой) упаривают подвакуумом, лиофилизируют, получают белый твердый остаток В 1123 Ф . Дополнительное количество ВМ 123 аб можноизвлечь дальнейшим проявлением блонки с углем 50%-ным подкисленным водным метанолом (рН 1,8, серной кислотой), получая дополнительно 16 фракций, Кислые, фракции объединяют, упаривают под вакуумом (до водной фазы),доводят рН едким барием до 7,2,фильтруют и лиофилизируют.При ферментации для избирательногопродуцирования в основном ВМ 123,6и ВМ 123приготовление инокулумапроизводят так же, как для ВМ 1 ДЗЫ,.Для получения ВМ 123в танке-ферментере обычно используют среду следующего состава, г:Декстроза 10,0Мясной экстракт 4,0Бактопептон 4,0Хлористый натрий2,5Дрожжевой экстракт 1,0В ода До 1000(мл)рН доводят едким натром до 7,0,Танк инокулируют 3-,10% полученногоинокулума. Аэрируют из расчета 0,2-0,3 лстерильного воздуха на 1 л бульона вминуту ферментационную смесь перемешивают мешалкой (50-200 об/мин).Температуру поддерживают 25-39 С,ообычно около 28 С. Продолжитбльностьферментации 45-85 ч.Отфильтровывают фермептационнуюмассу, содержащую ВМ 123 ф и ВМ 123используя в качестве фильтроввльноговспомогательного средства,1% диатомовойземли. "Пирог" промывают водой, фильтрвт объединяют с промывной жидкостьюи пропускают через 10- литровый слой13 С 50 ( ИЭф) под действием тяжести,со скоростью потока 330 мл/мин, Загруженную колоцку промывают водой,Действующее начало элюируют из колонки, используя 0,3,н. серную кислоту,Зпюат собирают в две порции, Перваяпорция содержит элюат с рН 7,0-5,0.Первую порцщо отставляют из-за высокого содержания соли, вторая порцияимеет рН около 1,4. Эту кислуюпорцию доводят едким барием дорН 6,0. Образующийся сульфат ба-,рия отфильтровывают через диатомовуюземлю, Пирог" промывают водой, объединяют фильтрат с промывной жидкостьюи упаривают под вакуумом, Концентратнагревают на паровой банедо 50 С ивносят в горячий раствор соли Рейнеке(150 г на 1500 мл при 75 С). Горячий раствор оставляют на 48 ч, затемотфильтровывают, получают пурпурно-красное твердое вещество. Его промываютводой. Влажное твердое вещество перемешивают со смесью воды и бутвнола(2:5) и доводят рН до 1,5 при помощи0,25 н. серной кислоты, Смесь отфильтровывают и водную фазу фильтратвдоводят до рН 6-8, вновь фильтруют иОвторой фильтрат упаривают под вакуумом,Койцентрат пропускают через колонкусо 100 мл Дауэкс 1-х 4 ( СГ) и лиофилизируют,Порошкообразную целлюлозу смешивают с верхней фазой полученной нри35смешении 90%-ного фенола, хлороформа,пиридина, уксусной кислоты (в соотношении 1500: 300: 45: 45: 750).Затем постепенно загружают в стеклянную колонку, через верхнюю часть, вы шеописаннуЬ лиофилизированную смеськомпонентов, растворенную в верхнейфазе, и смоченную порошкообраэную целлюлозу (1:2 объем/вес). Колонку проявляют под давлением воздухв иэ резервуара, присоединенного к верхней частистеклянной колонки. Всего собирают75 фракций (по 25 мл каждая), исгользуя автоматический коллекторфракций,Активность устанавливают биоавтографией бумажных кружков, высушенных на воздухе и промытых эфиром,до нанесения на большие агаровые плас35тины, засеянные К.ЗЩОФОи Ое, штаммА 2, Наблюдаются две отдельные активные полосы, Одна из них состоит(ВМ 123 ф ) - из фракций 31-52, Объе 4 Одиняют фракции 3-18 и вносят в хлороформ, образуется двухфазная система,Нижнюю фазу оставляют, а верхьюю водную фазу (рН 4,5) дважды экстрвгируютравным объемом эфира для удаленияоставшегося фенола, доводят до рН 6,545используя Я 45 (ОН ) лиофилизируюти получают ВМ 123 . Объединяют фракции 31-52, обрабатывают их аналогичным образом и получают ВМ 123 ф .Три антибактериальных средства срав-.нивают 1 М ч 1 Ро, используя разнообразныеграмположительные и грвмотрицательныебактерии, а также М,баефщбь методомразведения агара. Результаты в видеминимальной ингибирующей концентрацииприведены в табл, 4. Для сравнениявзят сульфат гентамицина.Антибвктериальные вещества ВМ 123 аВМ 123 Ь и ВМ 123действуют 1 И чьчОаа различные микроорганизмы. Их можно,5 О 5 ОО О 10 50 О 25 О,5 о Ъеи 3 огиопаз аеифкова РА 7баРаоиеРРа ДаРРщаат 1 едеРе 60ВаьиоиеИа 1 рЬоаа Атсс 6939МЩе РРа аЬфа 2,500 5,00 5,000 10,0 0,050 0,10