Способ получения синтетической двунитчатой рнк, обладающей интерферониндуцирующей активностью — SU 933001 (original) (raw)

О П И С А Н И Е п),933001ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Соцмалнстмчеснмх Республик(51) М. Кл. С 01 Х 33/48 63 дуаарстеенай камнтет СССР да дедам дзабретений н отерытдй(53) УДК Ь б 1 б..О 7(088.8) Дата опубликования описания 30.0.82 Иностранцы Хирофуми Аримура, Масанори Нагаи, Такеси Ямаути,Цутому Китагава и Тадаказу Суяма(5 Й) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СИНТЕТИЧЕСКОЙ ДВУНИТЧАТОЙ РНК, ОБЛАДАЮЩЕЙ ИНТЕРФЕРОНИНДУЦИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ Изобретение относится к биохимиии касается получения двунитчатой РКН.Известен способ получения синтетической двунитчатой РНК., обладающей интерферониндуцирующей активностью, путем использования человеческой ДНК в качестве матрицы для ферментативного синтеза 1).Однако известный способ не позволяет получить преперат, обладаю" щий высокой интерферониндуцирующей активностью.Цель изобретения - повышение .интерферониндуцирующей активности це к левого продукта.Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа получения синтетической двунитцатой РНК, обладающей интерферониндуцирующей З 1 активностью, путем использования. человеческой ДНК в качестве матрицы для ферментативного синтеза аденозинтрифосфорную, уридинтрифосфорную, гуанидинтрифосфорную и цитидинтрифос. р форную кислоты инкубируют с ДНК изчеловецеской плаценты в присутствииактивной РНК- полимераэы М 1 стосОссиз 1 узойеЖйсцз или ЕзсЬегсЫц со11 в течение 2-1 ч при 20"10 дС втрис-солянокислом буферном растворепри рН 7,0-8,0, образовавшуюся в результате реакции РНК отделяют от бел.ка обычными методами, отделенную отбелка РНК центрифугируют с использованием ИС 1 в качестве амортизатора, целевой продукт осаждают этано"лом и выдерживают в термостате при70-100 С, затем быстро охлаждают доокомнатной температуры или ниже,В соответствии с данным изобретением двунитцатую РНК получают в,результате ферментного синтеза с использованием в качестве матрицы ес"тественной человеческой ДНК,Двунитчатая РНК ферментативносинтезируется с помощью способа,при котором АТР, СТР, СТР и УТР реагируют друг с другом в присутствиив качестве шаблона естественной че001 20 19 933 Диализат (890 мл) подвергают ультра- фильтрованию с использованием пустстелого волоконного мембранного фильтра до сгущения до 19 мл.В 19 мл ультрафильтрованного кон центрата растворяют 19 г СуС 1. Затем общий объем доводят до 26 мл до бавкой 0,01 М буферного раствора триНС 1 (рН 7,5), содержащего С С 1 в пропорции 1 г на 1 мл буферного раствора. Этот раствор (26 мл) наносят на 7,8 мл 5,7 И СС 1 (рН 6,5), содержащих 0,1 И ЕДТА, затем наносят 1,3 мл 0,1 М буферного раствора три-НС 1 (рН 7,5) и все зто центрифугируют. З Центрифугирование проводят на роторе при 27000 об/мин (130000 х д) в течение 15 ч при 15 С.После центрифугирования всплывшее вещество удаляют и РНК в виде свет лых гранул растворяют в 30 мл 0,1 М буферного раствора три-НС 1 (рН 7,5) Полученный раствор охлаждают в водя ной бане при 0 С,и добавляют к нему два объема охлажденяого этилового В спита, все это отстаивают 1 ч при -20 С. Затем полученный осадок соби рают с помощью низкоскоростного центрифугирования. Всплывшее вещество удаляют и осадок вновь растворяют в 36 0,01 М буферном растворе три-НС 1 (рн 7,5).ФВыход очищенной РНК 8,6 мг в соответствии с расчетом из соотношения А 26022, где А 260 - спектральная поглотительная способность при .260 нм 1 мг/мл раствора РНК.При добавлении 50 ТСА в осадок выпадает примерно 80 очищенной РНК как нерастворимой фракции ТСА. Седиментационный коэффициент очищенной РНК, который измеряют с помощью градиентного центрифугирования сахарозной плотности с использовани" ем в качестве стандарта , мышиной Е-клеточной рибосомной РНК, равен примерно 12 с. Отжиг РНК, 3 мг очищенной РНК растворяют. в 4,8 мл 0,01 М буферного раствора три-НС 1 (рН 7,5) и добавляют к раствору 1,2 мл ЯЯС 10-кратной концентрации (рН 7,0) с тем, чтобы концентрация РНК в двухкратной концентрации ЯЯС стала равной 500 мкг/мл, Полученный таким образом раствор помещают в стек лянную пробирку с заглушкой, нагревают 5 мин при 108 С, быстро озлаждают в водяной бане при ОфС, затемпомещают в водяную баню при 85 С.Температуру водяной бани постепеннопонижают в течение 2 ч до 65 С, ирекция происходит 4 ч при 65 фС. Затем отключают нагреватель водянойбани, и раствор отстаивается ночьс постепенным охлаждением до комнатной температуры.Седиментационный коэффициент отожженной РНК определяют методом градиентного центрифугирования сахарозной плотности, Наблюдается пик при12 с, причем полученный результатпрактически не отличается от того,что был получен до отжига, однаконаблюдается небольшой новый пик вобласти примерно 28 с.Устойчивость рибонуклеазы отожженной РНК (число РНК -гибрида РНК; ко -личество двунитчатых частей) определяют по методу Гемперта. 30 мкг.отожженной РНК обрабатывают вместе с20 мкг рибонуклеазы бычьей поджелудочной железы и 2 мкг рибонуклеазыТ в растворе ЯЯС двойной концентрации (рН 7,0) в течейие 30 мин при37 ОС, в результате с помощью фильтрата (0,45 мкм) получают 13,3 нерастворимой фракции ТСА без следов дегидрирования,С другой стороны, 30 мкг образца,нагретые при 100 С в ЯЯС с концентрацией 0,3 и быстро охлажденные в воодяной бане при 0 С, подвергают рибонуклеазной обработке в ЯЯС двукратной концентрации, как упомянуто выше,в результате получают недегидрированных 2,3 нерастворимой фракции ТСА.Отожженная РНК регенерирована спомощью осадка этанола по типовомуметоду. Осадок диализируют с дистил"лированной водой, диализат стериализуют фильтрацией с разделением напробирки и подвергают лиофияизацииПолученные таким образом препаратыявляются индук 1 орами интерферона иобладают его физическими, химическими и биологическими свойствами.П р и м е р 7. Выделение и очищение ДНК человеческой плаценты,Процесс осуществляют по тому жеметоду, что и в примере 6.Очищение полимеразы РНК Е-.со 11.Штамм КЕ. со 1 х выращивают в питательном бульоне с использованиемЗаг Реппепйег, собирают на последней стадиии логирифмической фазыроста и хранят при -20 С. 250 г этих21 9330клеток суспендируют в 750 мл буферного раствора Грайндинга (0,05 Ибуферного раствора три-НС 1, рН 79)содержащего 5 Ф глицероля, 2 мИ ЕДТА,0,1 мИ дитиотреитола, 1 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,233 И ИаС 1 130 мкг/млбелого лизоцима куриных яиц и,;23 мкг/мл фторида Фенилметансульфонила) и отстаивают в .течение20 мин при 8 С, Затем добавляют 60,0125 объма 4 ДОС (дезоксихолатнатрия) и смесь перемешивают 39 с,После отстаивания в течение 20 минвновь перемешивают 30 с. Затем1000 мл ТСЕД + 0,2 И ИаС 1 (ТСЕД - И0,01 М буферного раствора три-НС 1(рН 7,9), содержащего 5 Ж глицерола,0,1 мМ ЕДТА и 0,1 мМ дитиотреито ла, ТСЕД + 0,2 М ИаС 1 - ТСЕД с содержанием 0,2 М 11 аС 1 ) бали добавлены к раствору и энергично перемешивались в течение 5 мин. Суспензиюоцентрифугируют 45 мин при 4 С и10000 х д. К полученному всплывшему веществу добавляют 0,075 объема 54"ного Ро 1 ущв Р (рН 7,9).Спустя 5 мин полученный осадок собираютцентрифугированием в течение 15 минпри 4 оС и 6000 х д. Осадок гомогенизируют в ТСЕД + 0,5 М ИаС 1 (ТСЕД с зосодержанием 0,5 И ИаС 1)гомогенатперемешивают 10 мин при 4 С, а затемоцентрифугируют 30 мин при 4 С и6000 х д. Полученный осадок гомогенизируют в ТСЕД + 1,0 М МаС 1 (ТСЕД ссодержанием 1,0 М ЬаС 1) и перемешивают при 4 С в течение 1 О мин. Гомогеоонат центрифугируют 30 мин при 4 С и6000 х д.К полученному в результатевсплывшему веществу добавляют сульфат аммиака в пропорции 35 г на100 мл, все это перемешивают 30 минпри 4 С. Затем суспензию центрифуги.-.оруют 45 мин при 4 С и 10000 х . Полученный осадок растворяют в 700 млТСЕД,Этот раствор пропускают сквозь колонку с агарозой и ДНК телячьей зобной железы (2,6 х 15 см), изготовленную в соответствии с методом,Шаллара, для поглощения полимеразы,РНК. Колонку промывают 500 мл ТСЕД++ 0,15 И ИаС 1 (ТСЕД с содержанием0,15 И ЯаС 1), затем 500 мл ТСЕД +1+03 М ХаС 1 ТСЕД с содержанием 0,3 И11 аС 1).После этого сквозь колонку пропускают. 500 мл ТСЕД +колонку пропускают 500 мл ТСЕД+лимераза РНКДНК человеческой плаценты 20 ед 000 0 мкг/ 0 м АТР 01 22разы РНК. К элюату добавляют суль-фат аммиака е пропорции 35 г на, 100 мл и перемешивают 30 мин приОбразовавшуюся супенэию под"вергают центрифугированию в течение30 мин при 4 С и 10000 х д. В результате получен осадок- раствор 7 млТСЕД + 0,5 М МаС 1 + 30 глицероля(ТСЕД + 0,5 М ХаС 1 эа тем отличием,что содержится 30 глицероля вместо5 о)Раствор делится на 2-3 равные части, и каждую часть подвергают фильтрованию сквозь гель через колонкус Био Гель А 5 м (Полиакриламидгель),уравновешенную ТСЕД0,5 И 1 ЯаС 1,Элюирование производят с ТСЕД ++ 0,5 1 аС 1. Из элюата извлекают фракции, обладающие активностью полиме"разы,РНК, и используют для синтеза РНК,Удельная активность полученной та,ким образом полимеразы РНК равна320 ед/мг протеина при определениипо методу Бургесса с использованиемв качестве матрицы ДНК эобной железытеленка.Единицу активности фермента определяют как количество, катализирующеевведение 1 н объема 14 С-АТР в материал нерастворимой ТСА в течение10 мин инкубации.Коэффициент спектральной поглоти"тельной способности между 280 и260 нм оказался равным 1,86. Суммар"ная активность полимеразы РНК, полученной из 250 г замороженных клеток,оказалась равной 30000 ед, а суммвр"ное количество протеина - 96 мг.Синтез, выделение и очистка РНК.Реагенты, предназначенные для синтеза РНК, приведены в табл. 3; (всего150 мл). Каждый реагент растворялся в 0,04 М буферного раствора триНС 1 (рН 7,9) .0,60,6 50 1 90 90 7,5 150 600 ИлС 1МФ 12"меркаптоэтанол 0,5 Три-НС 1,РН 7,9 0,04 Иуказанные реагенты тщательно сме шивают и помещают на 3 ч в термостат при 37 С. Затеи реакционную 26 смесь охлаждают в водяной бане при 0 С для окончания реакции, нагревают в течение 5 мин при 65 оС для инактивации полимеразы РНК и охлаждают проточной водой примерно до 37 С, затем и добавляют 16,7 мл 0,1 М МрС 1 , чтобы довести раствор до 10 мМ, После этого добавляют 1,7 мг дезоксирибонуклеазы (без примеси рибонуклеазы) и помещают в термостат на 30 мин прио37 С для дегидрирования, ДНК.Реакционную смесь нагревают дооЭ 100 С в течение 3 мин для инактивации дезоксирибонуклеазы,затем охлаждают проточной водой до комнатной темпера" , туры, После этого добавляют 170 мл ВАС двойной концентрации (рН 7,0). и 340 мл фенол-крезольной смеси (состав : фенола 500 г, м-крезола 70 мл, воды 55 мл, гидроксихинолина 0,5 г) . В течение 5 мин реакционную смесь встряхивают при комнатной температуре, затеи центрифугируют 10 мин при 5 С и 5000 х д. К отделенному от фенольного слоя . и слоя денатури 45рованного протеина всплывшему ве ществу добавляют половину объема Фенол-крезольной смеси и встряхивают при комнатной температуре в течение 5 мин.Эмульсию центрифугируют и всплыв" шее вещество диалйзйруют с 5 л .ЯС двойной концентрации рН 7,5), .содержащей 0,05 ЭБ, в течение 1 ч при комнатной температуре, и диализи", руют вновь в течение 1 ч после замены внешнего раствора, Затем внешний раствор заменяют 5 л ЗЗС концентрации 0,01 (рН 7,0) и диализ 01 24ведут еще в течение ночи при 2-5"С, Диализат (310 мл) подвергают ультра- фильтрации с использоввнием волоконного мембранного фильтра до получения 19 мл концентрата.В 19 мл концентрата, полученного поиультрафильтрации, растворяют .19 г С П. Затем общий объем доводят до 26 мл добавкой 0.01 М бфеоного раствора три-НС 1 (рН 7,5), содержащего СС 1 в пропорции 1 г на 1 мл буферного раствора. Раствор (26 мл) наносят на 7,8 мл 5,7 М СС 1 (РН 6,5), содержащих О,1 М бДТА, а затем туда наносят еще 1,3 мл 0,1 М буФерного раствора триНС 1 (рН 7,5) и центрифугируют.Центрифугирование ведут в роторе в течение 15 ч при 15 С и 27000 об/мин (13000 Ц х р).После центрифугирования удаляют всплывшее вещество и РНК в чистой грануле растворяют в 3 мл 0,01 М буФерного раствора три-НС 1 . (рН 7,5). Полученный раствор охлаждают в водяной бане при 0 С, добавляют два объема охлажденного этилового спирта и дают отстояться при -20 фС в течение 1 ч, Полученный осадок собирают с помощью низкоскоростного центри фугирования. Всплывшее вещество удаляют, и осадок вновь растворяют в 0,01 И буферном растворе три-НС 1 (рН 7,5)Выход очищенной РНК равен 9,0 мг.При добавлении 50 ТСА в осадок выпало примерно 90 очищенной РНК как нерастворимой фракции ТСА, Седиментационный коэффициент очищенной РНК, замеренный с помощью центрифугирования для определения градиента плотности сахарозы с использованием рибосомной РНК Е-клеток мыши в качестве стандаота оавен поимеоно 1 с.Отжиг РНК. 1 мг очищенной РНК растворяют в 12,0 мл 0,01 М буферного раствора три-НС 1 (рН 7,5), добавляют 3,0 мл ЯС с 10-кратной концентрацией ГРН 7,0) г тем, чтобы концентрация РНК в двукратной концентрации %С стала равной 200 мкгlмл, Полученный раствор помещают в стеклянную пробирку с пробкой, прогревают 5 мин при 100 С быстро охлаждают в водяоной бане, при 0 С, после чего помещают в водяную баню при 85 С. Температуру водяной бани постепенно понижают до 65 фС втечение 2 ч, и при 65 С реакция протекает еще 4 ч, За:26 01 Формула изобретения Составитель С. Малютина Редактор Н. Чубелко Техред И, Рейвес Корректор Г, РеЬетникЮ Е аЗаказ 3829/79 Тираж 883 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д 4/5 филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,25 9330тем отключают нагреватель водянойбани, и в течение ночи раствор отстаивается, постепенно охлаждаясьдо комнатной температуры.Устойчивость рибонуклеазы отожженной РНК (количества гибридной РНК"РНК;число двунитцатой гасти) определяютпо методу Гемперта и др. 30 мкготожженной РНК обрабатывают вместе с20 мкг рибонуклеазы бычьей поджелудоч 1 фной железы и 2 мкг рибонуклеазы- Т в33 С двукратной концентрации рН 7,0)при 37 фС в течение 30 мин, полученная в результате 12,0 нерастворимая фракция ТСА без дегидрирования 15была собрана миллипоровым фильтром(0,45 мкм) . С другой стороны,30 мкг образца, нагретых в мС 0,3концентрации в течение 5 мин при100 С и быстро охлажденных в водяной 20бане при 0 С, подвергнуты рибонуклеазной обработке, как упомянутоговыше, в результате собрано 3,3 нерастворимой фракции недегидрированной ТСА с помощью Фильтра. 25Отожженная РНК регенерирована спомощью осаждения этанола в соответствии с типовой процедурой. Осадокдиализируют с дистиллированной во -дой, диализат стериализуют фильтрацией, разделяют по ампулам и подвергают лиофилизации. В состав очищенной РНК входят, ь :адениловая кисло"та 27,3, амидиновая кислота 21,5,цитидиновая кислота 18,5, уридиноваякислота 32,7,Предлагаемый способ позволяет по"высить интерферониндуцирующую актив-ность целевого продуктаСпособ получения синтетическойдвунитчатой РНК, обладающей интерферониндуцирующей активностью, путемиСпользования человеческой ДНК вкачестве матрицы для Ферментативного синтеза, о т л и ч а Ю щ и йс я тем, что, с целью повышенияинтерферониндуцирующей активностицелевого продукта, аденоэинтрифосфорную, уридинтрифосфорнуЮ, гуанидинтрифосфорную и цитидинтрифосфорнуюкислоты инкубируют с ДНК из человеческой плаценты в присутствии актив"ной РНК- полимеразы М 1 с 1 ососсцБ1 узойедИсць или ЕзеИег 1 сИ 1 а со 1 хв тецение 2-4 ц при 1 =20"40 С в триссолянокислом буферном растворе прирН 7,0-8,0, образовавшуюся в результате реакции РНК отделяют от белкаобычным способом, отделенную от бел"ка РНК центрифугируют с использованием Св С 1 в качестве амортизатора,целевой продукт осаждают этанолом ивыдерживают в термостате при С=70- о100 С, затем быстро охлаждают докомнатной температуры или ниже.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Патент Японии М 2008/75,кл, 13 Е 4, 1975.ловеческой ДНК посредством каталитического дейтвия активной полиме. разы РНК для получения РНК с последующим отжигом получающейся РНК нагревом при 70"100 С и постепеннымоохдаждением до комнатной температуры или ниже для образования меж ду ее молекулами двунитчатых зон.естественную человеческую ДНК по лучают с помощью экстракции из тка ней человеческого тела обычным известным способом, в частности экстракцией с Фенолом, с Фенолом, насыщенным водой, или с фенолом, насыщенным буферным раствором. 1%Например, ДНК выделяется из че 1 ловеческой плаценты в соответствии со способом Пэриша, Замороженную при -20 фС человеческую плаценту гомогенизируют в присутствии 60 р"аминосалицилата натрия и Фенол-крезольной смеси для осуществления экстрак" ции нуклеиновой кислоты и депротеинизиции. Депротеинизация всплывающей на поверхность жидкости, полученной, у после центрифугирования с фенолкрезольной смесью, проводится еще раз. Нуклеиновая кислота выпадает в осадок после цинтрифугирования иэ всплывающей на поверхность жидкости. Осадок растворяют в слабом ионном растворе и добавляют высококонцентрированный. хлористый натрий для высаливания РНК, После удаления РНК с помощью центрифугирования удаляют остаток РНК, и высокоагрегированную ДНК; Затем с помощью ультрацентрифуги удаляют гликоген. Полученную из всплывшей Фракции ДНК осаждают и растворяют в слабом ионном растворе, Этот раствор диализируют с дистиллированндй во.дой, а диализат подвергают лиофилизации для получения в качестве лиофилизированного продукта естественной ДНК,45Полученная таким образом ДНК используется в качестве матрицы для полимеразации рибонуклеоидных трифос" фатов при каталитическом действии полимеразы РНК для синтезирования РНК Р РНК"полимераза означает обычно зави-, симую от ДНК полимеразу РНК и является Ферментом, катализирующим реакцию синтеза РНК посредством полимеризации рибонуклеоидных трифосфатов через двойную эфирную связь с использованием ДНК в качестве матрицы.Этот фермент специфичен, т.е. в качестве матрицы действует лищь ДНК,экстрагированная из того же источника, что и фермент. Однако используемая в качестве фермента активная полимераза РНК обладает низкойспецифичностью матрицы, так что длясинтеза РНК возможно использованиев качестве матрицы человеческойДНК,Для выделения и очистки активнойполимеразы РНК, например, в случае,когда она получена из М 1 сгососсю1 узойе 1 ИсоБ используется оригинальный способ Накамото, модифицированный частью усовершенствованногоспособа Вейсса. Для этого клеткисобирают на последней логарифмической Фазе их роста, хранят до исполь -зования в замороженном состоянии,апри использовании промывают и лиофилизируют. К этому экстракту добавляют экстракт сульфата стрептомицина для концентрации комплекса нукле"иновых кислот и нуклеопоотеинов. апосле элюирования полимеразы РНК изэтого комплекса посредством добавки фосфатного буферного растворавновь добавляют сульфат стрептимицина для выпадения в осадок избирательно лишь нуклеиновой кислоты.Этот осадок удаляют центрифугированием, а мембранные компоненты и рибосомную фракцию удаляют на ультрацентрифуге. Затем добавляют сульФат протамина для образования комплекса протамин-полимераза РНК, и полимераза РНК элюируется из этого комплекса с помощью фосфатного буферного раствора, Элюированная такимобразом полимераза РНК реагирует ссульфатом протамина для создания,еще одного комплекса, вновь элюируется из комплекса с фосфатным буферным раствором, а элюат подвергается фракционированию с сульфатом аммиака. Фракцию, осажденную с насыщением 30-50, собирают и обрабатывают с катионитом для получения очищенной полимеразы РНК, Активность полученной таким путем полимеразы РНКв диапазоне 50-10 000 ед/мг протеина.Затем осуществляют синтез РНК сиспользованием полимеразы РНК и человеческой ДНК в качестве матрицы.Смесь реактантов для синтеза РНК содержит Мед/мл полимеразы РНК,100-1000. мкг/мл ДНК, 0,2-2 мй АТР,СТР,СТР и ЛР соответственно в ка45 5 9330 честве основы, 1-4 мМ МпС 1 0-4 мМ гипохлорида спермидина и 0,01-0,1 М три-НС 1 (рН 7,0-8,0).Температура реакции 20-40 С, время реакции 1-10 ч. Хорошие результаты получают при продолжительности реакции 2-4 ч. Завершается реакция охлаждением и до" полнительными этапами обработки: дегидрироеанием полимеразы ДНК с помощью дезоксирибонуклеазы, удаления 1 е протеинов с помощью обработки в феноле, очисткой с помощью диализа. Затем диализат концентрируют посредством ультрафильтрации,а концентрат центрифугируют в ИС 1 в соответствии со способом Глизина для выделения РНК. Полученную таким путем РНК очи" щают осаждением с этанолом, а полученный продукт подвергают последующей реакции температурной обработ киЭта реакция, целью которой является получение двунитчатой РНК, проводится в соответствии с методом Робинсона и др. Реакцию выполняют 25 таким образом, что РНК растворяется в двойной концентрированной ЯЯС /стандартном солевом цитрате, 0,15 М ИяС 1, 0,015 М цитрата натрия) при величине рН 6,5-7,5,получившийся рэст 30 вор нагревают до 70-100 С, затем температура постепенно понижается до комнатной для окончания реакции. В данном случае желательны нагрев раствора до 70-100 С на 3 о10 мин быстрое охлаждение до комнатной температуры, затем повторный нагрев до 70- 100 С, после чего раствор вновь постепенно остывает до комнатной температуры. На этом этапе желательно долгое время поддерживать температуру между высокой и комнатной, По завершении реакции РНК восстанавливается с помощью осаждения из этилового спирта или подобным образом, полученный осадок центрифигируют и промывают затем растворяют в водном растворе хлористого натрия с малой концентрацией, подвергают диализу в воде при низкой температуре на протяжении 10-30 ч, при необходимости стериализуют фильтрацией, затем подвергают лиофилизации для получения препарата. Полученный таким образом индуктор интерферона в виде двунитчатой РНК, синтезированной с естествен,01 б ной человеческой ДНК е качестве матрицы,- белого цвета, без запаха,безвкусный, содержит по крайней мере примерно М (нормально 10- 15 Цдвунитчатых частей в молекуле.указанный индуктор интерферонав еиде двунитчатой РНК обладает следующими физическими и химическимисвойствами,Молекулярный вес. Седиментационный коэффициент определяют по градиенту плотности сахарозы при центри"фугировании (5-201 в роторе при38000 об/мин, 3,5 ч) с использова"нием в качестве стандарта рибосомной РНК Е-клетки мыши, В образецвходит 11-13 компонентов.Растворимость. Растворим в дистиллированной водс, в буферном растворе 0,01 М три-НС 1 (рН 7,5),.двойном концентрированном растворе ЗЯС,в растворе БИС с концентрацией О, 1(рН 7,0) и т.д. Нерастворим в этаноле и ацетоне,Спектр ультрафиолетового поглощения. 0,02 мг/мл водного раствора,образца дают спектр ультрафиолетовогопоглощения, типичный для нуклеиновойкислоты. Максимум поглотительной спо.собности приходится на 260 нм, а минимум - на 230 нм.Цветовая реакция. Реакция положительна при проверке орсинолом и отрицательна для дифениламина и индола соответствует характеристике цве-товой реакции РНК,Реакция осаждения. К 0,5 мг/млводного раствора образца добавляютраствор этанола двукратного объемаи дают отстояться в течение болеечем одного часа при -20 С. В осадок выпадает почти 100 материала,Дабавление половины объема охлажденной 50/-ной ТИ (трихлоруксусной кислоты) к.0,1 мг/мл водного раствораобразца переводит в нерастворимуюформу 80-90 РНК -ТСА, которую можно собрать с помощью фильтра(0,45 мкм).Дегидрирование рибонуклеазой. Образец растворяют в двойном концентрированном растворе БИС (рН 7,0) иподвергают обработке вместе с бычьей рибонуклеазой поджелудочной железы (10 мкг/мл) и рибонуклеазой7 93300 8 протеина и ДНК не наблюдается.Ю Наблюдения под электронным микрон9Я в растворе ЯЯС (рН 7,0) с концентра.цией 0,3, нагревают , затем быстро, охлаждают и обрабатывают вместе супомянутой выше рибонуклеазой послеперенесенияраствора в раствор ЯЯСдвойной концентрации. В результатенепоглощенными остаются 2-3.Поглощение дезоксирибонуклеазой.Образец растворяют в 0,0 1 И буферного раствора три-НС 1 (рН 7,4) и обрабатывают с дезоксирибонуклеазой(50 мкг/мл) при 37 дС в течвние30 мин. Полученная в результате пропорция нерастворимой Фракции ТСА таже, что и при укаэанной выше обработке, причем увеличение поглотительной способности при 260 нм не заметно, ни до, ни после обработки,Чувствительность к щелочному гидролизу. Образец растворяют в 0,3 М щгидроокиси калия и выдерживают при37 С в течение 18 ч. Образец гидролиэуется полностью. Анализ продукта гидролиза с помощью тонкослойной хооматографии показывает лищь 2отдельные пятна адениловой кислоты, амидиновой кислоты, цитидиноеой кислоты и уридиновой кислоты,Состав. Анализ ,.остава выполняют с помощью тонкослойной хроматографии на продукте щелочного гиддолиэа . В результате анализа установлено, что молярное отношение каждого нуклеотида находится в диапазоне 27,0-30,5 адениловой кислоты,20,6-24,74 амидиновой кислоты, 6824,3 цитидиновой кислоты, и 27,832,7 уридиновой кислоты.Плотность на всплывание образцав С 304,Плотность на всплывание образца вСфО измеряют с помощью ультрацентрифуги (Яр 1 псо ЯИ 50,1 ротор,31500 об/мин 72 ч), Она равна 16351640.Термическая денатурация рибонуклеаэы - стойкость РНК. Образец растворяют в растворе ЯЯС (рН 7,0) концентрации 0,1, температуру плавленияопределяют в соответствии со способом К, Колби и Д. Г. Дьюсберга. Онаоказалась равной 71 С,Спектральная поглотительная способность увеличивается с повышениемтемпературы, Образец растворяют в растворе ЯЯС .(рН 7,0) с концентрацией 0,1, затем определяют увеличениепоглощения при 260 нм при повышениитемпературы. Наблюдаются воэрастание примерно на 201 в диапазоне температур 2-90 С,Чистота. Оценку чистоты образца выполняют следующим образом,Количество протеина определяют по методу Фолина-Лоуни, а количест во ДНК - по ЯЯТ-методу, модифицированному Мицуно и др, Загрязнений скопом. Наблюдения под электронныммикроскопом показывают, что большинство молекул РНК являются линей" ными, длина их 0,1-3 мкм,Двунитчатая РНК, обладающая описанными выше физическими и химическими свойствами, может быть использована в качестве интерферона по той причине, что она индуцирует интерФерон и обладает чрезвычайно малой токсичностью.При изготовлении различных медицинских препаратов-стабилизаторов, среди которых могут быть человеческий альбуминманнитол и, др., агенты повышенной растворимости глицин и такие вещества, как сорбитол - могут быть добавлены к раствору до проведения лиофилизации, причем раствор уже.содержит активный материал. При использовании изготовленный таким образом медицинский препарат растворяют (в Фиэиологическом растворе, стериализованной воде, стерилизованном изотоническом растворе для инъекций и т.д.) и назначают пациентам в качестве индуктора интерферона посредством внутривенных, мышечных или подкожных инъекций.Эффективная доза от 1 до 2 мг на килограмм веса тела в день, при необходимости доза может быть увеличена,Препарат эффективен в качестве лекарства даже в неочищенном виде, т.е. в смешанном состоянии с однонитчатой РНК, достаточно эффективны 4 Ф или более двунитчатой РНК,Биологические свойства препарата подробно описаны в примерахП р и м е р 1.Противовирусную активность определяют измерением вирусной производительности в соответствии с частично модифицированным методом. Т,е. 0,0; 1,0; 10 и 50 мкг/мл образцов индуктора интерФерона (препарат по настоящему изобретению и Ро 1 у 1:С в качестве контро4 рЕи - бляшкообраэующая единица,П р и м е р 2 . Активность индуцирования интерферона проверяют добавкой предлагаемого препарата к культивированным клеткам. Этот тест проводится с использованием метода Вилцека, при этом 2 мл среды МЕМ Игл (без сыворотки), содержащей 5- с 50 мкг/мл возбудителя интерферона и 100 мкг/мл циклогемиксида, добавляют к клеткам НЕБ, образовавшим монослой в пластиковой чашке Петри диаметрсм 6 мм. Клетки выдерживаюто в термостате в течение 5 ч при 37 С. К среде добавляют О,5 мл актиномици-,с тем, чтобы окончательная конна. ля), 50.мкг/мл декстрана ДЕАЕ (молекулярная масса 50 х 10 ) и 3 мл минимальной среды Фирмы Игл (далее упоминаемой как МЕМИгл), дополненных 0,54утробной телячьей сыворотки, добавля- зют к однослойным клеткам (2,5-3 х 10 фклеток/колбу) в 50-мл колбы для выращивания культур, затем выдерживают при 37 ОС в течение 20 ч. После ин.инкубационного периода среду Игл МЕМ, 10 содержащую возбудитель интерферона,удаляют и клетки трижды промывают соляным раствором Хенкса, затем добавляют вирусы Чеь 1 сц 1 аг зйова 11 йВ(1.ЬЛ.) с кратностью инфекции от 2 15до 3 бляшкообразующих единиц на клетку. Вирусы адсорбируют при 37 ОС в течение 1 ч. После адсорбции для уда" ления свободных вирусов Ч.Б.Ч. клетки промывают пять раз и добавляют 205 мл новой содержащей среды (средаМЕМ Игл, содержащая 14 утробной телячьей сыворотки). После инкубационного периода. продолжающегося 20 ч при37 С клетки охлаждают в холодильни зР0ке при -30 С. Охлаждение и оттаивание повторяют дважды, затемклетки направляют на центрифугу(2000 об/мин, на 10 мин). Титр вирусов во всплывшем веществе определя- Зоют с помощью анализа культур клетокГЬ. Вирусы с клеток, обработанныхсредой МЕМ Игл без возбудителя интер.Ферона (с содержанием сыворотки илиДЕАЕ - декстрана), используют какконтрольные.Использованные клетки относятся кдвум разновидностям установленных .клеточных линий человеческих амниотических клеток гЬ и клеток почки кролика БХа также целовецеских зародышевых диплоидных клеток крайнейплоти (НР) и человеческих зародыше,вых почечных клеток НК. Гетероплоидные клетки клеток НК первоначально45рассаживались примерно 130 раз,Эти клетки выращивают в средеМЕМ. Игл,дополненной 1 ОФ утробной телячьей сыворотки, 100 мкг/мл пенициллина 6, 100 мкг/мл сульфата стрептомицина и 60 мкг/мл канамицина. По за.вершении инкубаиии виоусов клеткикультивируют в среде, в которой количество сыворотки уменьшено до 13.Клетки культивируют в инкубаторе ссодержанием СО ,5/ СО),Используемое в качестве контрольного вещества Ро 1 у 1:С, расмотренноев фосфатном буферном растворе/ рн /,О) с концентрацией 2,5 мг/мл,. хранилось при -30 С, а при использовании разжижалось.Результаты приведены в табл, 1, откуда видно, что хотя между клетками есть небольшое различие, противовирусная активность препарата та же, что и у Ро 1 у 1:С.Т а б л и ц а 111 9 центрация стала равной 1 мкг/мл. Зао тем продолжают в течение 1 ч при 37 0 инкубацию. После полного завершения; инкубациИ клетки промывают соляным раствором Хенкса пять раз, затем добавляют 5 мг ИЕИ Игл с 0,53 сыворотки. После 20 ч инкубации при 37 С среду собирают и центрифигиру ют (1000 об/мин) в течение 5 мин для получения всплывшего вещества, содержащего интерферон. Тест на интерФеоон проводят с использованием клеток Р 1Тест на интерферон проводят по модифицированному методу Вилцека Ионослойные клеточные культуры в плас тиковой цашке Петри промывают и прививают двум разведенным в два раза образцам интерферона в среде МЕИ Игл, содержащей утробную телячью сы" воротку, затем помещают в термостат на 20 ц при 37 фС. После промывки клеточных слоев их подвергают действию примерно 100 РКц на чашу вирусов Ч.Я.Ч., а полученные пластинки подсчитывают после двух- или трехдневной инкубации. Титр интерферона выражают как величину, обратную числу разбавления образца, уменьшавшего число бляшек на 504 от контрольного, на которое была нанесена среда ИЕИ Игл вместо образца. Титр образца интерферона человеческих клеток определяет одновременным определением стандартного человеческого лейкоци.тарного интерферона для преобразования в мейдународные единицы (1 Ц). В качестве контрольного используют Ро 1 у 1:С.Предлагаемый препарат проявляет большую активность индуцирования интерферона по сравнению с Ро 1 у 1:С.П р и м е р 3. Действие интерферона в живом организме,Кроликам"самцам весом 2,0-2,5 кг .проводят внутривенную инъекцию 10100 мкг/кг препарата или Ро 1 у 1:С в качестве контрольного средства. Непосредственно до инъекции, а также после,), 2, 4, 8, 11 и 24 ч после инъекции у кроликов берут кровь.Рктивность индуцирования интерферона определяют анализом содержания интерферона в полученной сыворотке, Метод титрования интерферона аналогичен упомянутому методу Вилцека и др. за тем исключением что вместо клеток Н, используют клетки ВК33001 12Предлагаемый препарат проявляетактивность индуцирования интерферона в живом. организме, равнуюили превышающую активность Ро 1 у 1:С.3 П р и м е р 4, Тест на токсичность.Изучается эффект предлагаемогопрепарата и Ро 1 у 1:С в качестве контрольного средства на культивирован ных клетках, При этом в колбу 5 мл одновременно помещают 4 мл суспенэиичеловеческих амниотических клетокН. (60 х 10 ф клеток на 4 мл), а также 1 мл среды ИЕИ Игл, содержащей 3 550 и 250 мкг/мл (растворенных окончательно в 5 раз) препарата. Клеткикультивируют при 37 С в течение 6днейПосле 2, 4 и 6 дней культивации З 1 отбирают по две колбы иэ каждой группы, для удаления плавающих клеток ихпромывают Фосфатным буферным раствором. Оставшиеся клетки отделяют отстеклянной поверхности с помощью 2 з 0,021 этилендиамин-тетрацетата (ЕДТА)и трипсина (0,254) для подсчета ихчисла. Затем число жизнеспособныхклеток подсчитывают с помощью окращивающего вещества эритроцина 8 и гемоцитомера.Контрольный препарат Ро 1 у 1:С донекоторой степени токсичен даже приконцентрации 1 мкг/мл, при 10 мкг/млтоксичность существенно заметна апри 50 мкг/мл размножение клеток ненаблюдалось. В противоположностьконтрольному получаемый препарат необнаруживает токсичности при концентрации 10 мкгlмл или меньше, размножение клеток подавляется лишьочень незначительно даже при концентрации 50 мкг/мл. Из приведенных экспериментов видно, что полученный препарат является средством возбуждения интерферона, обладает противовирусной активностью, примерно равной или превышающей активность Ро 1 у 1:С, и в сравнении с ним является менее токсичным.П р и. м е р 5. Острую токсичность полученного препарата проверяют, используя самцов мыши Г ВЕ, в соответствии с методом Лидица и Вилкоксона.Результат показал, что от внутри- брюшного введения препарата на уровне 50 мг/кг веса тела или при внутривенном вливании на уровне 25 мг/кг гибели мышей не было.13 9330Для мышей доза ЬД при подкожномвведении препарата - не менее50 мг/кг, при внутривенном введении -не меньше 25 мг/кг,Получение синтетической двунитчатой РНК поясняется следующими примерами.П р и м е р 6. Выделение и очищение ДНК человеческой плаценты.Плаценту, замороженную непосредственно после родов и хранившуюсяпри -20 С, измельчают на куски до60 г, к ней добавляют 15 обьемов63-ного раствора аминосалицилата и15 объемов смеси Фенола с крезолом(состав: фенол 500 г, и-крезол 70 мл,вода 55 мл и 8-гидроксилхинолин 0,5 г).Полученную смесь гомогениэируют прикомнатной температуре в течение од -ной минуты в смесителе при максималь-Мных оборотах. Полученную таким образом суспензию размешивают при комнатной температуре в течение 20 мин,затем центрифугируют в течение 30 минпри 5 ОС и 6000 х д для удаления дена-Итурированного протеина и фенола. Квсплывшей жидкости добавляют хлористый натрий с тем, чтобы его конечная концентрация стала равна 33,а также половину объема всплывшей 30смеси Фенол-креэола. Смесь размешивают при комнатной температуре втечение 20 мин, затем центрифугируют в течение 1 О мин при 5 С и8000 х д.3К всплывшей жидкости добавляютдва объема охлажденной этиловойспиртово-крезольной смеси (объемноеотношение 9:1) и осторожно смешива- .ют для образования осадка. После то- мго, как волокнистый осадок намота-ют на стеклянный стержень, оставшуюся жидкость отстаивают 1 ч при2 С, затем оставшийся осадок восстанавливают центрифугированием, Общий осадок тщательно промывают в до"статочном объеме 75/-ного этилового .спирта с содержанием 2 ацетата;натрия и полностью растворяютв 200 мл 0,1 М ацетата натрия,содержащего 5 мМ фторида натрия. Кэтому раствору добавляется хлористыйнатрий с конечной концентрацией 3 И.Этот раствор отстаивают в течение15 ч при (-2) -(-5) С и центрифугируют 1 О мин при 5 С и 12000 х .К всплывшей жидкости добавляют водный объем охлажденной этилцеллю01 14 лозы и осторожно смешивают до получения белого волокнистого осадка. После отстаивания в водяной бане при 0 С в течение 20 мин волокнистый осадок извлекают с помощью стеклянного стержня, диспергируют и растворяютФ при комнатной температуре в 300 мл 3 М буферного раствора ацетата натрия (рН 6,0), содержащего. 5 мИ фторида натрия. Когда растворение почти полностью завершится, раствороцентрифугируют при 5 С в течение 10 мин при 2000 х д для удаления остатоцной РНК и сильно агрегированной ДНК в качестве осадка.К всплывшему веществу добавляют равный объем охлажденной втилцеллюлозы, и смесь отстаивают в течение 20 мин в водяной бане при 0 С. Полученный волокнистый осадок наматывают на стеклянный стержень, диспергируют и растворяют при комнатной температуре в 200 мл О,1 М буферного раствора ацетата натрия (рН 6,0), .содержащего 5 мМ Фторида натрия. Когра растворение завершится почти полйостью, раствор центрифугируют в течение 90 мин при 5 С и 60000 х т для удаления гликогена как осадка.К всплывшему веществу добавляют ацетат натрия с конечной концентрацией 0,3 М и смешивают с равным объемом охлажденной этилцеллюлозы. После отстаивания в течение 20 мин в водяной бане при 0 С волокнистый осадок собирают.с помощью стеклянной палочки и растворяют в 16 мл 0,1 М буферного раствора ацетата натрия (рН 6,0), содержащего 5 мМ Фторида натрия.По завершении растворения раствор передают в диализный трубопровод и диалиэуют в течение 48 ц при 2 5 С с 200 мл дистиллированной воды, пятикратно сменяя внешний раствор. Диализат центрифугируют для удаления нерастворимых материалов и определяют концентрацию ДНК посредством из" мерения коэффициента поглотительной способности при 260 нм разведенного всплывшего на поверхность вещества.Расчет концентрации ведут с учетом того, что коэффициент спектральной поглотительной способности при 260 нм 1 мг/мл ДНК равен 20. Растворы с содержанием 6,5 мг ДНК помещают в пробирки 10 мл и подвергают лиофилизации. После проведения указанных процедур получаютв сумме15 933040 кг человеческой ДНК, Для оценки чистоты препарата ДНК определяют количество протеина по усовершенствованному методу Лоури. Количество РНК определяют по методу Мицуно.Протеина было О,И в виде альбуми" на человеческой плаценты, РНК было 4,8 от общего числа нуклеотидов.. Очищение полимераэы РНК, На питательном бульоне выращивают М 1 сгососсцз 1 узодеЖСхсцз с использованием ЛЯГ Репввйег. По достижении послед-. ней логарифмической стадии роста их собирают и хранят - при -20 С, 400 г замороженных клеток диспергируют в 2 л 0,0 И буферного раствора три-НС 1 и центрифугируют, чтобы соб", рать промытые клетки, которые затем диспергируют в 0,01 М буферном растворе три-НС 1 (рН 8,0), содержащем 26 0,2 М сахарозы, для получения конечного обьема 2 л. К этой суспензии добавляют 600 мг белого лизоцима куриных яиц, и суспензию выдерживают в термостате при 30 С. После 15 мин 2оинкубации добавляют 6 мл 0,1. И МдС 1 д и выдерживают в термостате еще 45 мин для разрушения стен клеток. Затем добавляют 8 мл О, М Мф:1 и 2400 мл воды, охлажденной до ОС. Зе Смесь энергично перемешивают. 8 се процедуры проводят в водяной бане при 0 С, Через 1 О мин дсбавляют 600 мл 04-ного сульфата стрептомицина, а еще через 10 мин полученный . осадок центрифугируют в течение10 мин при 5 С и 20000 х д. Полученный осадок суспендируют в 800 мл 0,01 М буферного раствора три-НС 1(рН 8,0), содержащего 0,2 И сахарозы, 0,14 сульфата стрептомицина и 0,00035 М МдС 1 , Через 10 мин раствор центрифугируют при 5 дС в течение 10 мин при 20000 х р,. Осадокгомогенизируют в 720 мл раствора, приготовленного смешиванием 8 мл 1 И буферного раствора Фосфата калия (рн ,5) 8 мл О, и ИРС 1, 80 мл2 И сахарозы, разбавлением смеси дистиллированной водой до 720 мл с использованием тефлонового гомогенизатора фирмы Поттер-Элвейхем. К этомугомогенату добавляют 32, мл, М буФерного раствора фосфата калия (рН 7,5), а еще через десять минут -, 70 мл 1 ОФ-ного сульфата стрептомицийа.После1 О мин перемешивания полученный осадок отделяют центрифгированием втечение 30 мин при 5 С и 30000 х д, О 16 а полученное в результате всплывшее вещество подвергают дальнейшему цент рифугированию при 5 С в течение 2 чпри 105000 х д для удаления компонентов мембраны и рибосомной фракции.К 800 мл полученного при ультрацентрифугоровании всплывшего вещества добавляют 110 мл 1 М буферного оа" створа фосфата калия (рН 7,5),а затем 160 мл 2,5-ного ненейтрализованного сульфата протамина для выделения полимеразы РНК в осадок как комплексного соединения с сульфатом протамина. После 10 мин перемешивания осадок собирают с помощью центрифугирования в течение 1 О мин при 5 С и 20000 х д. Осадок гомогенизируют в 180 мл 0,2 И буферного раствора фосфата натрия (РН 7,5), содержащего 0,2 И сахарозы для элюирования полимераэы РНК. После 10-минутного перемешивания суспензию центрифугируют в течение.1 О мин при 5 С и 30000 х ц. К всплы- . вшему веществу добавляют 360 мл 0,1-ного сульфатного раствора ненейтрализованного протамина, и вновь полимераза РНК выпадает в осадок как комплексное соединение с сульфатом протамина. После 1 О мин перемешивания суспенэию центрифугируют в те" чение 15 мин при 5 С и 20000 х ц. Осадок гомогенизируют в 50 мл О,4 И буферного раствора Фосфата калия (рН 7,5), содержащего 0,2 М сахарозы, и гомогенат подвергают центрифугированию в течение 10 мин при 5 С и 30000 х д, Собранный осадок гомогенизируют в 30 мл 0,2 М буферного раствора фосфата калия (рН 7,5), содержащего 0,2 М сахарозы для элюирования полимеразы РНК, После О мин ,перемешивания суспензию центрифугируют в течение 15 мин при 5 С и 30000 хд,К всплывшему веществу (30 мл ) добавляют 7,27 г сультата аммиака с тем, чтобы получить 40/-ное насыщение для осуществления фракционирования сульфата аммиака. Спустя 15 мин после добавления сульфата аммиака суспензию центрифугируют в течение 10 мин при 5 оС и 30000 х д;Осадок растворяют в 5 мл 0,02 М буферном,растворе три-.НС 1 (рН 7,5), содержащем 0,3 И сульфата. аммиака , и добавляют равный обьем глицероля, Раствор разбавляют в 2,5 раза, 0,01 И буферным раствором триНС 1 (рН 7,5) и пропускают сквозь СМ-целлюлозную колонку в стеклянномаблиц ОчищеннаяполимераэаРНК ед/мл 100 ДНК человеческой плацты ед/мл . 100 мг200 АТР СТР 55,4 ,4 ,4 СТ фильтре, приготовленном с испольэова" нием 2,4 г СМ-целлюлозы для удаления рибонуклеазы. Колонку промывают 0,01 М буферным раствором три-НС 1 (рН 7 5), содержащим 20 глицероля 5 и 0,06 М сульфата аммиака, и элюат пропуекают .сквозь колонку СМ-целлюлозы, приготовленной с использованием 0,8 г СМ-целлюлозы,После промывания колонки к сум марным 80 мл элюата добавляют 22,2 г сульфата аммиака для осуществления осаждения сульфата аммиака. Через 15 мин полученный осадок собирают центрифугированием в течение 15 мин 15 при 5 С и 30000 х д, а полученное таким образом осажденное веществорастворяют в 4 мл 0,02 М буферного раствора три-НС 1 (рН 7,5), содержещего 0,3 М сульфата аммиака, а 26 потом добавляют равный объем глицероля и до использования хранят при -70 С.Из 400 г замороженных клеток получают 43 мг препарата полимеразы 25 РНК с удельной активностью 190 ед. на мг протеина (суммарная активность 8200 ед) и отношением спектральной поглотительной способности при 280 : 260 нм 1,5536Одна единица ферментной активности определяется как количество, катализирующее при введении 1 н моль 14 С - АТР нерастворимый ТСА матери-. ал в течение 10 мин инкубации35Каждый реактив. растворяют в 0,1 М буферного раствора три-НС 1 (рН 7,5).В табл. 2 приведены используемые при синтезе РНК реагенты, общее количество 500 мл. 46Т а 2нпС 1Ненейтрванныйхлориддина 0 лизо- ригидроперми 100 Три-НС 1рН 7,5Указанные выше реагенты тщательно смешивают и выдерживают в термостате в течение 3 ч при 30 С в водя-. ной бане, Затем эту смесь охлаждают в водяной бане при 0 С до окончания реакции и нагревают в течениео5 мин при 65 С для инактивации полимераэы РНК. Реакционную смесь охлажд дают примерно до 37 С проточной во". дой, затем к ней добавляют 56 мл О, М МдС 1для доведения раствора до 10 мМ. Затем добавляют 5,6 мг дезоксирибонуклеаэы (без рибонуклеа зы) и помещают в термостат на 30 мин при 37 С для дегидрирования ДНК.В течение 3 мин реакционную смесь нагревают при 100 С для инактивации дезоксирибонуклеазы, затем охлаждают проточной водой до комнатной темпервтуры.,После этого к ней добавляют 560 мл двойной концентрированной ЯЯС (рН 7,0) и 1120 мл фенол-крезоль" ной смеси (состав: фенола 500 г, " ю-, м-креэола 70 мл воды 55 мл, 8-гид" роксихинолина 0,5 г). В течение 5 мин реакционную смесь встряхивают, затем центрифугируют в течение 10 мин при 5 С и 5000 х д. Отделенное от фенольного слоя и слоя денатурированного протеина всплывшее вещество получает добавку половины объема упомянутой выше фенол-крезоль ной смеси, затем его встряхивают при комнатной температуре в течение 5 мин.Полученное посредством центрифугирования всплывшее вещество вновь диализируют. с 5 м .раствора ЯЯС с двой" . ной концентрации (рН 7,0). содержащего 0,05 додецилсульфата натрия (упоминаемого далее как ЯЭЯ), 1 ч при комнатной температуре и еще 1 ч после замены внешнего раствора. После этого внешний раствор заменяют 5 л 0,01 концентрации ЯЯС (рН 7,0) и ди ализ продолжают всю ночь при 2-5 С.

Смотреть

Способ получения синтетической двунитчатой рнк, обладающей интерферониндуцирующей активностью