Способ получения сиропа, содержащего глюкозу и фруктозу — SU 1449014 (original) (raw)
СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН Н ПАТЕНТУ СИРОПА, СОУКТОЗУится к техноно-фруктозныхния - уменьуктов распадаи повышениев процессе изоГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Набиско Брэндз Инкорпорейте(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕРЖАЩЕГО ГЛЮКОЗУ И Ф (57) Изобретение отно логии получения глюко сиропов. Цель изобрет шение образования про сахаров в гидролизате стабильности фермента 801449014 А 3Р 4 С 13 К 11/00 С 12 Р 19/24 меризации. Способ получения сиропа, содержащего глюкозу и фруктоэу, предусматривает приготовление крахмаль" ной суспензии, ожижение последней при рН 5,2-5,4, последующее ферментативное осахаривание при рН 4-,5 и температуре 54-62 С для получения гидролизата, содержащего не более00 ч./млн. ионов кальция в расчете на массу сухого крахмала и с молярным отношением неферментативно образуемых кетозных сахаров 0-2 моль на 100 моль гексозных единиц. Для ожижения используют глюкоамилаэу, имевщую пониженную зависимость от ионов кальция. Содержание ионов кальция 3 не более 100 ч./млн обеспечивают путем хелатирования избытка кальция перед изомеризацией, Осахаренный раствор подвергают изомеризации при необходимой температуре контактировани" Я ем его с глюкоэоизомеразой, адсорби,рованной или связанной с ДЕАЕ цел- ффффф люлоэой или анионообменной смолой. 4 з.п. ф-лы., 10 табл.1аблица 4 Показатель Вторая стадия Первая стадия Количество фермента (ликвофоны Ы -амилазы Г 688) 8 оТемпература, С 86 86 Время; ч 2 е 5 2,0 П р и м е ч а н и е. Время автоклавирования междустадиями 1 мин.енных, образцовРастворы анализируют на содержание использованием глюкозы и мальтозы и молярное отноа (АИОВайсЬ шение кетосахаров. ц а 5 Таб лиВлияние рН ожнжения и температуры автоклавирования настабильность глюкозной изомераэы и на эффективностьпревращенияч1 Иэомеризация субстрата Варьируемые параметры ожижения Эффективностьфермента, К ). Периодполураспада,,09 21 14490 нуть важность условий, при которых готовится неочишенный субстрат.П р н м е р 3. Иллюстрирует влияние рН и температуры автоклави 5 рования, используемых во время окикения крахмала, на стабильность изомериэующих ферментов н на эффективность реакции конверсии.Пять одинаковых образцов зернового 10 крахмала (333 сухого вещества) ожиТ 20 л аждог из ожижкрахмала осахаривали сглюкоамилаэного составЗН 3068, Яочо Епвуше Согр.) при концентрации 0,41 СИ г йвв. Образцыдово, дят до рН 4,3 и нагревают при 54 С в те- Зб чение 32 ч. Осахаренвые растворы отфильтровывают и упаривают до содержания сухого вещества 503, рН доводят до 6,5 с помощью И 80, Затем в каждомобразце создают концентрацию И 8(НЗО) 0,0025 М и наконец доводят рН до 7,8 (определено при 25 С) с помощью ЮаОН. 14 22кают, используя Теппашу 1-60 Е с 6 -амнлазу по двухстадийному способу прнразличных значениях рН и условияхавтоклавнрования. Образцы ожижают при условиях (продолжительности, температуре, содерзании фермента), приведенных в табл,4. Неочищенные растворы изомериэуют пропусканием через стеклянные колонои, находящиеся при 60 С и содержащие иммобилизованную глюкозоизомеразу при скорости потока 0,3 мл/мнн Общая активность фермента в каждой колонке составляет 800 1 С 1 И,Результаты изомериэации приведены в табл.5.Та блица 1Непрерывный процесс ферментативной изомернэациигидролиэатов, влияние на стабильность фермента Реактор(в серии) Ео Время (1 С 1 И) иэомеризации, ч КонстанПериод полураспада, с,ч Эффективность ферменл+ф та, Кс та скок рости,К2300 720 0)160 810 0,150 1000 О, 160 1140 0,160 1060 0,159 1030 13,0 1320 2 3075 3 4150 4 5000 5 6000 15,0 1320 18,2 1320 17,0 600 16,4 Средние 0,158 1030значения 16,3 г (С+У)1 С 1 Ич ;г (С+Р)1 С 1 ИккРеактор 1 убрали из начальной позиции в цепи через720 ч работы и после этого в конец цепи установилиреактор 5. 44,3 51,6 фруктоза, Е Глюкоза, Х0 Р+ (включает ди- и полисаха 15 14490 и вьщеркивают при этой температуре в течение 4 мин, затем осуществляютоупаривание при 58 С и давлении 625 мм рт.ст. Добавляют М 8(НЯО) в таком количестве,.чтобы концентрация его составляла 0,002 моль, затем доводят рН раствора до 7,8 (определено при 25 С) раствором КаОН. Затем раствор перекачивают через смеситель" 10 ный змеевик и фильтр с фнльтровальной бумагой при 58 С,Изомериэацию осуществляют, перекачивая отфильтрованный субстрат через четыре реактора со слоями катализато ра соединенных сериями, и находящихВося при 60 С. Реакторы представляют собой стеклянные колонки диаметром 2,54 сми длиной 15,24 см, содержащие переменные количества иммобилизованной Периодический анализ изомеризованного раствора дает следующие значения в расчете на массу сухого вещества: 14 16глюкозоиэомераэы. Количество глюкоэоизомераэной активности в каждом реактора изменяется в пределах от 2,300 до 5,000 1 С 1 И. Реакторы работают следующим образом. Отработанные реакторы, стоящие в начале цепи, удаляются и заменяются чистыми реакторами, стоящими в конце цепи. Изомеризацию осуществляют при скорости введения потока 2,4 мл вещества в 1 мин, при этом концентрация фруктозы в конечном вытекающем потоке составляет 42"463. После завершения времени пребывания в каждом реакторе отбирают пробу вытекающего потока для получения сравнительных данных.Результаты изомеризации неочищенного гидролизата представлены в табл.1.риды), Ж 4,1Кальций, ч/млнОульфатированнаязола, Х 0,28Сухое вещество, Х 48,6Приведенные данные, а также данные, приведенные в табл.1, указывают, что глюкозно-фруктозный сироп, содержащий большой процент фрук тозы, можно получить, подвергая неочищенный крахмальный гидролизат, полученный при описанных условиях, изомеризации с иммобилиэованной глюкозоизомеразой. Эти данные ука зывают также, что при описанных условиях ферменты имеют высокую устойчивость или период полужизни Г) и высокую степень ферментной активности (К.) .20П р и м е р 2. Иллюстрирует действие различных условий на ожижение и осахаривание крахмала, на образование неферментно полученных кетоэосахаров в глюкозосодержащем субстрате и на устойчивость глюкозоизомеразы, используемой для изомеризации глюкозы в фруктоэу.Крахмал ожижают в отдельных опытах, в одном из которых используют З 0 Ы-амилаэный состав, полученный из В.1 сЬепхГогппэ, и в другом опыте используются -амилазный состав, полученный иэ В.зоЬ 1 цз, активность которого в большей степени зависит от содержания кальция. Ожижение производят в две стадии при ферментной обработке с промежуточным автоклавированием с целью получения частичного гидролиэата, практически свободного 40 от гранулированного или нежелатинизированного крахмала.Готовят две идентичные крахмальные пульпы, каждая иэ которых содер жит 337 сухого веществаОдну пульпу, субстрат А, обрабатывают о -амилазой, полученной из В.1 хсЬепГогшдз, при условиях ожижения, описанных в изоб ретении. Другую пульпу, субстрат В, Б 0 обрабатываютос "амилазой, полученной из В.зцЬП 1 з (Пех,о-НС. Уа 11 егзедп Со), и ожижение осуществляют в тех условиях, которые обычно используются для ожижения крахмала с использованием ферментного состава.Условия, в которых осуществляютожижение, показаны в табл.2.Таблица 2 Субстрат АВ.11 сЬеп 1 г огппз условия ожижения Субстрат ВВ.зцЬй 11 э 6,6 5,2 рН СаО Мео рН устанавливалиПервая стадия Ликвофоны, г33 14 Температура, С 86 88 Время, ч Автоклавирование Температуо ра, С 125 150 1 1 Время, мин Вторая стадия Ликвофоны, г 10 Температуа ра, С Ъ86 88 Время, ч Каждый из ожиженных крахмальных составов разбавляют до содержания сухого вещества ЗОХ, рН доводят до 4,3 и добавляют 0,41 СИ гглюкоамилаэы. Осахаривание осуществляютопри 58 С в течение 32 ч (для субстрата А) и 55 ч (для субстрата В). Осахаренные растворы отфильтровывают и упаривают до содержания сухого вещества 507 в вакууме при 35 С.Для изомеризации с иммобилизованной глюкоэоиэомеразой готовят три субстрата. Субстрат А был 0,0025 М по М 8(НБО) и рН доводят до 7,8 с помощью раствора ОаОН, Субстрат В сначала обрабатывают стехиометрическим количество щавелевой кислоты при рН 4,8. Содержание кальция в субстрате понижают до 30 ч/млн в расчете на сухое вещество. Раствор затем повторно от+ Молей кетоэы на 100 моль дегидрогексо г (С+Р) 1 С 1 И меризацииКрахмал ри условиях,Осахаренный использование ния 01 са 1 дйе, о содержания сконцентриро и жижают римере труют ильтро ривают а 50 Х,веденных враствор филускорителяфильтрат упхого вещест суВарьируемые параметр озиженияСодержание мальтозы в субстратах зависит как от значения рН при ожижении, так и от температуры автоклавирования. Как показано данными табл.5, содержание мальтулозы изменяется противоположно периоду полураспада изомеразы, что указывает на то, что условия ожижения, промотирующие неферментное образование предшественников мальтулоэы, неблагоприятно сказываются на устойчивости фермента. Эти данные свидетельствуют также о том, что количество глюкозы, образующееся во время осахаривания, уменьшается с увеличением содержания мальтозы.П р и м е р 4. Иллюстрирует влияние температуры, при которой выдерживают неочищенный субстрат до иэомеризации на устойчивость глюкозоизомеразы и эффективность реакции изованному раствору добавляют такоеколичество 5 Х-ного раствора М 8(НБОэ),чтобы субстрат был 0,0025 М, и рНодоводят до 7,8 при 25 С с помощью ЗО наОН.Раствор порциями перекачивают через колонку с рубашкой, поддерживаемую при какой-либо температуре, укаэанной в табл,6. После 30-минутного 35пребывания в колонке при одной изуказанных температур субстраты ох"лаждают, отфильтровывают и анализируют на содержание глюкозы и ке"тосахаров. Аналогично анализируютпорцию щелочного субстрата, которуюне подвергают нагреванию.Порции субстрата иэомериэуют поотдельности беэ предварительнойочистки пропусканием через стеклян ные колонки с рубашками, поддерживаемые при температуре 65 С, каждая изкоторых содержит слой иммобилиэованной глюкозоизомераэы с активностью800 1 С 1 И. Изомериэацию осуществляютв течение 500 ч при скорости введения потока в колонку 0,3 мл/мин.Результаты приведены в табл.б.26 25 1449014 Таблица бВлияние температурной обработки субстрата на стабильностьглюкозной изомеразы и на эффективность превращенияг Эффективностьфермента,Периодполурасладафермента, ч,Анализ субстрата Темперао тура, С Глюкоза, Хсухого вещества Нефермен- Молярноетативная отношефруктоза ние Мальтулоза, 7 сухого вещества 0 10 0,10 0,05 Комнатная 95,3 11,4 484 0,43 0,43 0,05,94,8 70 8,5 351 1,35 1,35 0,05 93,8 80 4,6 220 3,42 3,38 91,4 0,07 О, О 5,84 2,0 89,5 100 ФМолей кетозы ца 100 моль дегидрогексозыг (С+Г) ТСУИ Данные табл.б свидетельствуют о том, что более высокотемпературная обработка промотирует образовдние цефермецтатцнцо-образованных кетосдхдров, в частности фруктозы, в губстрдтдх, приготовленных в соотнетс.гвцц с предпочтительцымц. условиями ожцжецця и осахаривания, Соответственно понижается содержание глюкозы в субстрдте.П р и м е р 5. Пллюстрирует зависимость устойчивости глюкозоизомеразы и эффективности конверсии изомериздциц при использовании неочищенного крахмального гидролизата, полученного известным способом.Способ получения кр хмдльного гцдролизата подчеркивает, что во время очистки субстрата необходимо удалить из него нсшества, ццгцбирующие ;ц; - тиность глюкозоизомердзы.1 срдхмдл, полученный из зерна лрп мокром помоле, суспецдцруют в деионпзцронаццой воде до ксвцецтрдции сухого вещества 337., рН пульпь доводят до 6,5 с помощью МРО и добавляют такое количество-амилазного состава, полученного из 3,1 сЬепЫогшз (Теппату 1-60 Ь), чтобы ее концентрация составляла 20 ликнофоц 20 г" с 1 нз. Ожижецие осуществляют перекачинанием пульпы со скоростью 12 мл/мцц через змеевики из нержавеющей стали, в которых пульпа находится при 105-107 Св течение 7 мин. Затем пульпу охлажодают до 95 С и выдерживают при этой З 0 тсмпердгуре в течение 1,5 ч во втором змеевике. Частичный гидролизат(37 сухого. вещества), имеющий ПЕ1 ц,б и свободный от сырого крахмала,что было установлено тестом цд цод,перед осдхарцвацием выдержцвд.от при60 С.Ожижецный крдхмдл рдзб ндцкт досодержания су".сого нещвстна 307, рНдоводят до значения 4,5 ц добдвллюттакое количество глюкодмцлдвсгосостава (Бочо. АМС), чтбы создать концентрацию 0,25 СН цд граммс 1 нз. Обрабатьндемое нсщесгво цдгреЩвают н течение 48 ч при 60 С при 45 сохранении указанного ньипе значениярН. Затем осдхдреццый раствор отфильтровывают с использованием ускорителя фильтрования Мса 11 е СР,фильтрат концентрируют до содержания сухого вещества 49,6 Х н вакуумоном испарителе при 43 С, Анализраствора свидетельствует, что содержание глюкозы составляет 95%, асодержание мдльтулозы составляетоколо 0,27.Для приготовления субстрата дляизомеризации готовят раствор0,002 М по М 8(НЯО) и доводят рНдо 7,9 с помощью раствора ХаОН. Рдст1449014 28Держащую слой иммобилизованной глюкозоиэомераэы с активностью 1000 1 С 1 И со скоростью потока 0,4 мл/мин. Изо 5меризацию осуществляют в течение 570 чРаствор кристаллической декстрозы изомеризуют при тех же условиях в качестве контрольного опыта.Результаты приведены в табл.7. 27вор выдерживают при 65 фС в течение 20 мин и затем отфильтровывают.Субстрат подвергают иэомеризадии иммобилизованной глюкозоиэомераэой без предварительного рафинирования или очистки, Изомеризацию осуществляют пропусканием субстрата черезо колонку, находящуюся при 65 С и соТаблица 7 Влияние предварительной очистки гидролизата на стабильностьглюкоэной иэомеразы и эффективность превращения без очистки Анализ субстрата Субстрат Эффективностьфермента,люкоза, 7, сухого вещества Иальтулоза, Е сухого веКетоза, молярное отноше ние щества 99,8 (0,10 0,05 0,026 528 13,7 Контроль Субстрат изранее известного 94,9 0,19 0,10 0,021 545 11,6 случая Молей кетозы на 100 моль дегидрогексозы;г (С+Р) ч 1 С 1 Иг (С+Р)ф 1 С 1 И Результаты свидетельствуют о том,что субстрат с низким содержаниемкальция и неферментативно образуемыми кетозосахарами не требует глубокого рафинирования перед изомеризацией. Этот Факт находится в прямомпротиворечии с ранее известным вданной области,П р и м е р 6. Иллюстрирует изомеризацию нерафинированного крахмального гидролизата, приготовленного способом кислотно-ферментативного превращения.Крахмал, полученный из зерна путем мокрого помола, суспендировали в деионизированной воде до содержания сухого вещества 333, рН пульпы доводят до 2,2 концентрированной соляной кислотой. Ожижение осуществляют перекачиванием пульпы поддавлением через змеевик из нержавеющей стали со скоростью 22 мп/мин,пульпа при этом находится при температуре 135-140 С в течение приблизительно 4 мин, затем давление приводят к атмосферному. рН,доводят до значения 4,0-4,4 непрерывным добавЗ 5 лением гидроокиси натрия и темпераотуру понижают до 60 С, Среднее значение Р.Е. ожиженного крахмала составляет 18,Приблизительно 70 л ожиженного4 О крахмала осахаривают, Фильтруют иконцентрируют, как описано в примере 5, за исключением того, что значение рН поддерживают на уровне 4,4а общее время осахаривания составля 45 ет 62 ч. Осахаренный раствор с содержанием сухого вещества 50,37 доводят до значения И 8(НЯО ) , чтобыконцентрация последнего составляла0,002 моль, затем рН доводят дозначения 7,8 с помощью раствора гидроокиси натрия. Осахаренный растворподвергают дальнейшей термообработке,фильтруют и изомеризуют в условиях,описанных в примере 5. Изомеризацию55 осуществляют в течение 667 ч.Результаты, приведенные в табл.8,сравнивают субстрат изомеризованнойкристаллической декстроэы с неочищенным кислотно-ферментативным субТаблица 8 Изомеризация неочищенного гидролизата крахмала) обработанного кислотой и ферментомПериод Эффективполурас- ность лада, ч фермента,К6 Анализ субстрата Константа скорости К +Субстрат Кетоэа;молярноеотношение" Глюкоза, 3 сухого вещества Мальтулоза, , сухого вещества Кристаллическая декстрозл (контроль) сО)05 0)026 528 13,7 99,8 (О)10 Кислотно- ферментативная обработка 12,7 90,6сО) 10 с 0,05 0,023 551 ФМолей кетозы на 100 моль дегидрогексозы; фф г (С+Г) ч- тСТИ-;г (С+Р) 1 С 1 И Результаты анализов крахмальныхгиролизатов на содержание мальтулозь. дают 0)1 Х для состава Л и среднеезначение 1)107 для состава Б.Каждый состав отфильтровывают иконцентрируют до содержания сухоговещества 507. в вакууме, затем создают концентрацию 0,0025 М по М 8(ИБОпосле чего рН доводят до значения 40 7,9 с помощью раствора гидроокисннатрия. Оба состава неочищенных крахмальных гидролиэатов непрерьнно пропускают через змеевик, находящийсяпри 60 С, со скоростью 0)4 мл/мин) 45 время прохождения змеевика составляет20 мин, Составы фильтруют и затемподвергают иэомеризации пропусканиемчерез стеклянную колонку с рубашкой,поддерживаемую при 65 С при скорости 50 потока 0,4 мл/мин. Каждая колонка содержит слой иммобилизованной глюкозоизомеразы (Бмеегуще-Туре Б.ВагсЬУ 70122, производимой фирмой Ночо1 пдцсге) Пепшаг 1 с обладающей 55 общей активностью 800.Результаты приведены в табл,10П р и м е р 7. Иллюстрирует использование глюкозоиэомеразы, полученной из Вас 111 цз соаяи 1 апв микроорганизмов для изомеризации глюкозы в фруктозу в соответствии с предлагаемым способом.Готовят два крахмальных гидролизата в тех случаях, которые были описаны в примере 3, за исключением значения рН ожижения и температуры автоклавирования. Эти условия, использованные для каждого из составов А и В, приведены в табл,9. Таблица 9 1 Показатель Состав А Состав В Значение рН ожижения 6,7 5,2 Температура автоклавирования, С 125 150-16029 144901430стратом, Эти результаты свидетельст" щего низкий выход неферментно полувуют о том, что крахмальный гидро" ченных кетосахаров, можно успешно лизат, полученный способом кислот- подвергать иэомеризации без предвано-ферментативного превращениядаю- рительного рафинирования,Ое 05 Оэ 0260 947 0,55 0,0262 551 24,2 871 О,14,4 660 1,10 озы; 50 ВНИИПИ Заказ 6858/59 Тираж 308 Подписное Произв,-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ФМолей кетозы на 100 моль дегидрогексг (С+Р) ч 1 ГТИ1г (С+Г) тСтИ-,Данные табл, 10 показывают важность поддержания условий, приводящих к низкой концентрации мальтулозы в нерафинированном гидролизате. 20Позитивное воздействие на стабильность глюкозоизомеразы и на эффективность общей конверсии, происходящие вследствии использования реакции изомеризации крахмального гнд ролизата, полученного по предлагаемому способу, позволяет избежать необходимость рафинирования гидролизата до стадии изомеризации. При тщательном контроле условий ожижения крахма ла, сахарификации и хранения получают субстраты, для которых уровень веществ, вредно влияющих на устойчивость глюкозоизомеразы, таков, что становится возможным экономичное 35 получение глюкозно-фруктозных сиропов из нерафинированных гидролизатов. Формула изобретения40 1. Способ получения сиропа, содержащего глюкозу и фруктозу предусматривающий ферментативное ожижение исходной крахмальной суспензии, ферментативное осахаривание ожиженной суспензни, удаление из гидролизата нерастворенных частиц и изомеризацию гидродизата путе: контактированпя его с иммобилнзнрованной глюкозоизомеразой при температуре, достаточной для его осуществления,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью уменьшения продуктов распадасахаров в гидролизате и повышениястабильности фермента в процессе иэомеризации, процес,с ферментативногоожижения крахмальной суспензии осуществляют при рН 5,2-5,4, а ферментативное осахаривание ожиженной суспензии - при рН 4-5 и температуре54-62 С для получения гидролизата,осодержащего не более 100 ч./млн.ионовкальция в расчете на массу сухогокрахмала и с молярным отношениемнеферментативно образуемых кетозныхсахаров менее 2 моль на 100 мольгексозных ед,2. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что для ожиженияиспользуют глюкоамилазу, имеющую пониженную зависимость от ионов кальция3. Способ по п.1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что содержаниеионов кальция не более 100 ч./млнобеспечивают путем хелатироваиия избытка кальция перед иэомеризацией.4. Способ по п.1, о т л и ч а ющ н й с я тем, что процесс ожиженияпроводят при содержании ионов каль"ция не более 30 ч./млн.5. Способ по п.1, о т л и ч а ющ н й с я тем, что для иэомеризации используют глюкозоизомеразу, адсорбированную или связанную с ДЕАЕцеллюлозой или анионообменной смолой.Изобретение относится к технологии получения глюкозно-фруктозных сиропов.Цель изобретения - уменьшение5 образования продуктов распада сахаров в гидролиэате и повышение стабильности фермента в процессе изомеризации.Способ получения сиропа, содержа О щего глюкозу и фруктозу, заключается в следующем.Крахмал, полученный из обычного источника, например влажным измельчением зерна, промывают и готовят из 15 него водную пульпу - суспензию, содержащую 30-35 сухого крахмального веществд. Предпочтительнее, чтобы суспензия обладала низким ионным содержяээием т,ене Оолее 0 .А сухого 20 остатка в ниде сульфатированной золы. В качестве источников крахмала используются клубни или злаковэе включая картофель тапиоку, пшеницу, сорго и кукурузу. 25Глюкозосодерждщий крахмальэый гидролизат может быть получен с помощью кислотно-ферментного пронсссд или фермент-ферментного процесса. В кислотно-ферментном процессе крдкмаээ ожижают сперва Мягкой кислотной обрдботкой, после чего применяют фермент для превращения ожиженного крахмдла в глюкозу. В обычном фермент.-ферментном процессе крахмал ожижают обрыботкой с(-амилазой после чего применяют глюкоамилазу для превращения ожиженного крахмала в глюкозу, Предпочтительно использовать фермент-ферментный способ получения крахмального 4 О гидролиэата, содержащего глюкозу,Производство крахмального гидролиздта, содержащего глюкозу, который не будет подвергаться очистке перед последующей обработкой иммобилизи рованной глюкозной изомерд.,ой, требует тщательного контроля услоний реакции во время ожиження и осдхдривания, Должны применяться такие тгмпердтуры, время реакции и величины рН, цтобы ингибировать образование значительных количеств таких веществ, которые пагубно влияют на стабильность глюкозной пзомеразы.Также необходимым является сведение к минимуму содержание ионов кальция при изомеризации субстратд, Некоторые составы с-амилазы требуют присутствия высокого содержания ионов кальция для достижения активности во время стадии ожижения. В том случае, когда во время ожижения имеется высокая концентрация ионов кальция, то перед изомеризацией следует его удалить из гидролизата. Могут применяться любые известные для этой цели способы, такие как обработка глюкозосодержащей суспензии щавелевой кислотой с последующим фильтрованием ок" салатов кальция.Поэтому предпочтительнее использовать вид О -амилазы, который не требует высокой концентрации ионов кальция для поддержания активности и термостабильности фермента. Удовлетворительные результатыполучаются при использовании Ы-амилазы производимой Вас 111 ыэ 1 э.сйепхГогппз (Тег-, шашу 1-60 Ь о-амилаза Ночо Епгуше Сотр.). этот фермент отличается высокой термостабильностью и активностью в широком интервале рН, одновременно он имеет пониженную зависимость от ээрн,:утстния ионов кальция. Лругим типом подходящей о(-амилаэы который моээет быть использован для данной цени, являются Та 1 со-Трепп (М 1 еэ 1 а 1 э, гд 1:оту Е 1 кпагг. дпйдапа) и Нэ.- 1 сш 1 дэе (Вдосоп 1 по., Ьехэ.пя 1 оп.1.цс у) .Время, в течение которого осуществляется ожижение крдхмдлд закусит от применяемой темнердтурь . Если крахмальная суспензия ндгревается при низких темпердтурдх тэ тецсние очень короткого времени то нкет остаться значительное ко:,нэ:эо более термоустойцивых цдстнц крахмала, которые не будут подиерэ дся воздействию -амилазьэ как д д требуется для сэижения ндд. сэ д суспензии. Применение низкэх " мпс рд эур ожижения, а именно ниже ВОэО нлл зер - нового крдхмдлд, нриээодит летворителэ ным результатам н э-дд ос - тдвшегося неже.эдтжшзированэнэм большого количеств,э крдхмала и тдким образом практически неприспособленного к воздействию фермента, В том случае, когда ожижение осуществляется в присутствии О(-амилазы то применяемые темпердтуры не должны быть столь высоки, чтобы пагубно скдзаться на активности применяемого фермента.Особенно важным оказывается поддержание таких условий реакции, цтобы144901 30 во время ожижения и осахаривания не осуществлять химического или неферментативного образования кетосахаров. Вчастности, условия реакции должны5поддерживаться такими, чтобы обеспечить получение гидролизата сконцентрацией ионов кальция не более00 ч./млн, в основе на массу сухогокрахмального вещества и молярным отношением неферментативно образуемыхкетозных сахаров по отношению к гексозам менее 2,Предпочтительно также, чтобы гидролиэат содержал ионы кальция в концентрации не более 30 ч./млн и молярное отношение неферментативно образуемых кетосахаров было менее 1.Молярное отношение выражает количество молей неферментативно производимых 2 ркетосахаров на 100 моль гексоз. Поскольку влияние температур, времени ивеличины рН во время ожижения взаимозависимы, то зти параметры должныконтролироваться внутри сравнительно 25узкого интервала.Полимерная структура гранулированного крахмала не подвержена сильному воздействию Ы.-амилазы до техпор, пока гранулы не подвергнутсяжелатинизации. Желатиниэация осуществляется при нагревании крахмзлав воде до температурного интервала,при котором гранулы набухают, и силы, связывающие молекулы крахмала35вместе, достаточно ослабевают, чтовызывает желатинизацию. Посколькуос -амилаза термочувствительна иимеет тенденцию денатурироваться притемпературах выше 100 С, то для пролонгирования эффективного действияфермента для ожижения применяютсятемпературы ниже 100 С. Посколькуосилы, связывающие молекулы крахмалав гранулы, различны по величине, тонекоторые гранулы желатинизируютсяпри температурах ниже 100 С и становятся восприимчивыми к действиюМ -амилаэы, в то время как другиеостаются нежелатинизированными и поэтому достаточно устойчивыми к воздействию этого фермента, В результате этого предпочтительно ожижатькрахмал х-амилазой в две стадии сочень короткой промежуточной обработкой в автоклаве. Во время первойстадии крахмал частично желатиниэируется и ожижается в ограниченнойстепени с получением частичного гид 4 4ролизата. Целью стадии автоклавирования является дальнейшая желатиниэация гранул крахмала, устойчивых к воздействию обработки на первой стадии ожижения. Крахмальный гидролизат затем разжижают на второй стадии до требуемого уровня.Ожижение проводят в две стадии при рН в интервале от 5,2 до 5,4 и при температурах желатинизации крахмала, подходящих для ферментативного ожижения крахмала. В случае влажно-измельченного зернового крахмала обычно необходимо доводить величину рН до требуемого диапазона ожижения. Соединения кальция, как например гашеная известь или карбонат кальция, обычно используют для доведения величины рН на стадии ожижения с-амилазой, особенно в реакциях, где применяются о-амилазные составы, зависящие от кальция. Поскольку кальций отрицательно влияет на активность глюкозной иэомеразы, то предпочтительно избегать избыточного добавления источника ионов кальция к гидролизату. Однако если ионы кальция ксе-же добавлены, то их следует удалить до стадии изомеризации. Хотя существует целый ряд веществ, которые могут устанавливать необходимую величину рН во время стадии ожижения, однако предпочтительнее использовать для этой цели растворимые соединения магния, поскольку глюкозные изомеразы, выделенные из многих микроорганизмов, требуют магний для оптимизации их активности. Количество эС-амилазы, введенной в пульпу, зависит от набора факторов, однако обычно определяется по активности ферментативного состава, концентрации крахмала в пульпе и степени требуемой амилолитической конверсии. Обычно в системе двухстадийного ожижения ввлдт на вторую стадию такое же количеств или несколько меньшееМ-амилаэы, чем на первую стадпо. Когда между стадиями осуществляют автоклазирование, то остаточная активность М-амилаэы на первой стадии практически разрушается. Обычно на первой стадии добавляется Ьед. Ъ-эмплазной активности на 1 г сухого крахмала и 5- 10 ед. наг сухого крахмала на второй стадии ожижения.5 14Применяемые температуры ожижения на обоих стадиях предпочтительно ниже 100 С, более предпочтительными являются температуры в интервалео82-95 С и наиболее предпочтительным оказывается диапазон между 84 и 88 С. При ожижении при температураховнутри вьппеуказанных интервалов удовлетворительные результаты достигаются при нагревании в течение 1-3 ч,Первая стадия ожижения обеспечивает получение частичного гидролизата со степенью упругости от около 6 до около 12. После первой стадии ожижения пульпу можно подвергнуть автоклавиой обработке для получения частичного гидролизата, который практически свободен от нсжелатинизированного крахмала. Более продолжительное воздействие на частично ожиженный крахмал в автоклаве приводит к образованию веществ, которые нежелательны для глюкоэной изомеразы и которые необходимо удалять перед стадией изомеризации для удлинения срока действия фермента. Таким образом, время автоклавирования и температура не должны превышать 2 мин и 160 дС соответственно. Предпочтительнее проводить автоклавирование при температуре около 125 С и продолжиотельности 1 мин.Поскольку 0( -амилаза, присутствующая на первой стадии ожижения, практически инактивируется за время автоклавной обработки, то необходимо ввести дополнительное количество фермента на вторую стадию ожижения. Обычно вводимое количество о-амилазы на второй стадии приблизительно равно тому, которое применялось на первой стадии. Во время второй стадии практически все желатинизированные гранулы крахмала готовы взаимодействовать с ферментом в тех же условиях с образованием уточненного гидролиэата, имеющего степень упругости от 14 до 20, и который практически свободен от исходного непрореагировавшего крахмала. Обычный гидролизат имеет степень упругости около 16.Ожиженный крахмальный состав затем обрабатывают глюкогенным ферментом при подходящих условиях для ферментативного превращения частично гидролизованного крахмала в глюкозу. Обычно фермент, применяемый для этой це 49014 6ли, представляет собой глюкоамилаэу 5 10 15 20 25 30 3540 45 50 55(также обозначаемый как амилоглюкози" даза, глюкоамилаза, глюкогенный фермент и т.д.). Глюкоамилаза, вырабатываемая рядом микроорганизмов, представляет собой экзо-амилолитический фермент, который катализирует последовательный гидролиз глюкозных частей из невосстановленных концов крахмала или амилодекстриновых молекул. Среди микроорганизмов, производящих глюкоамилазу, имеются определенные штаммы грибков, относящихся к роду Аврег 811 цв, штаммы рода Кйворцв и штаммы рода Епдошусев.Осахаривание ожиженного крахмального состава осуществляют в условиях, которые приводят к высокой степени превращения крахмала в глюкозу, Предпочтительно, чтобы гидролизат содержал более 923 глюкозы и более предпочтительно, чтобы содержание глюкозы было более 947. Условия также должны быть такими, чтобы не промотировать повторный синтез олигосахаридов из молекул освобожденной глюкозы, как это известно случается при реакциях осахаривания с использованием глюкоамилазы.Обработку глюкоамилазой осуществ" ляют при разбавлении ожиженной крахмальной суспенэии, если это необходимо, до содержания твердых веществ около ЗОБ и достижений рН реакционной среды от 4,0 до около 5,0, предпочтительно рН 4,6, Затем добавляют достаточное количество глюкоамилазного состава для обеспечения от 0,12 до 0,30 глюкоамилазных единиц на 1 г сухого крахмального субстрата, после чего суспензию нагревают до температуры 54-62 С в течение времени, достаточного для получения необходимой степени конверсии, Предпочтительным является период от около 58 до около 60 ч для обработки суспензии гидролизованного крахмала.Для получения субстрата, пригодногс для изомеризации, гидролиэат затем фильтруют для удаления некрахмального остатка и фильтрат предпочтительнее упаривают до около 503 сухого вещества. Может быть добавлена растворимая соль или соли, являющиеся активаторами глюкозной изомеразы к концентрированному гидролизату, после чего уровень рН7 14 доводят от 7 0 до 8,5 добавлением раствора гид 1.оокиси натрия. Обычно гидролизат нагревают до температуры 50-70 С и выдерживают н течениео20-60 мин, после чего осадок отфильтровывают и удаляют сусгендированные твердые вещества, которые могли образоваться при более высоких уровнях рН. Предпочтительными условиями является нагренание при температуре около 60 С и выдержка н течение около 30 мин перед стадией повторного фильтрования. Следует избегать более продолжительного нагревания осахаренного раствора или нагревание при температурах выше 70 дС до стадии изомеризации и особенно не следует доводить значение рН в щелочную область. В щелочвк условиях такое нагревание гидролизата перед его изомеризацией может привести к разложению вещества и образованию продуктов, которые подавляют активность глюкозой изомеразы.Изомеризацил неочищенного субстрата преимущественно проводится в непрерывном режиме путем пропускания субстрата прц подходящих условиях через колонну или колонны, содержащие слои иммобилиэованой глюкозной изомеразы. Таким образом, при поддержании условий ожижеция ц осахэривания для минимального производства цефермецтативно получаемых кетосахарон происходит максимальное превращение крахмала в глюкозу. Также в результате поддержания низкого содержания золы в исходной крах эльной пульпе и во время цоспедоватеп цых стадий процесса потребуется меньшая емкость иоц-обменной смолы для деминерэлизациц кое ного гпюкозцо-фруктозного продуктаДекстрозцый эквинэлет.Декстрозцый эквивалечт (ДЕ) обозначает концентрацию присутствующих редуцирующих сахаров таких, как декстроза, и рассчитанных как процент от сухого вещества. Определяется с помощью методики Е, описанной в "Бсапйагй Апа 1 уг 1 сл 1 МесЬойя оГ СЬе МешЬег Сошрэп 1 ея оГ Согп Тпйцяйгу КеяеагсЬ Гоцпйа 1 оп, 1 пс. "1001, Соппес 1 сцг Аче, Г 1.М. ИаяЬ 1 пГоп, П.С. 20036. 49014 8Активность бактериологической0(-амилазы,Активность составов бактериологической О(-амилазы определяют с помощьюмодифициронанцой стандартной методики испытаний ААТСС 103-1965 "ВасСег 1- а 1 А 1 рЬа Ашу 1 аяе Епгуше 11 яед 1 п Рея 1 г 1 щ, Аяяау,оГц опубликованной в10 1967 году издательством ТехническойДокументации Американской АссоциацииТекстильных Химиков и Химиков-красителей, т. 43, с. В,и В.Модификации этого опубликованного15 теста заключаются в следующем.Буфферный раствор крахмальногосубстрата приготовляют растворением25,3 г сухого едкого цатра и 340 гсухого гранулированного калийдигидро 20 фосфата н воде и рэзбавлецием раствора до 2 л.К охлажденному и растертому в пасту крахмальному субстрату добавляют15 мл буферного раствора, после26 чего субстрат доводят до 500 млобьема,Определяют величину рН крахмального суб трата и при необходимостивеличину рН доводят до 6,2010,05.30 0,025 Г 1 раствор хлорида кальцияиспользуют для разбавления образцаФермента. Его готовят растворением1,1 г безводного гранулировачногохлорида кальция в воде и доведением3 Б жидкости до объема в 4 л.Формула перевода единиц - ВЛИ впикнофоцы: ВАИк 2,65 = пикнофоцы,а 0 Активность глюкоамилазы,Единицы активности глюкоамилазы.15 цижеописацной методике.10 мл 102-ного рэствора частичногидролизовацного крах".ала (такогокак Ма 1 гг 1 п, продукт Сга 1 п Ргосеяя 1 пд Со., Г 1 цясанце, Лоача), со 50 держащего 20 мМ ацетэтцого буфера срН 4,5, переносят пипеткой в закрытый реактор, подлержцвэемый при 60 С.1 мл глюкоамилазого раствора, содержащего 0,03-0,15 СИ, добавляют в реактор и перемешивают содержимое, после чего смесь оставляют стоять в течение 1 ч при 60 ОС, В конце первогочаса периода инкубации воздействиефермента прекращают добавлением пред 9 14 варительно определенного объема 1 М раствора едкого натра так, чтобы довести величину рН до 8,5-10,5. После этого смесь охлаждают до комнатной температуры.Полученный таким образом образец гидролиэата объеиои в 2,5 мл переносят в 25 мл раствора Фелинга, приготовленного как описано в случае определения ДЕ. Смесь затем нагревают до кипения и оттитровывают стандартным декстрозным раствором, содержащим 5 г декстрозы на 1 л, приготовленным в соответствии с методикой определения ДЕ. Контрольную смесь готовят и оттитровывают аналогичным образом как и для образца вьппеуказанного гидролиэата за исключением того, что к субстрату добавляют 1 мл раствора глюкоамилаэы после одночасовой инкубации и после добавления раствора едкого натра. Активность глюкоамилаэы рассчитывают следующим образом СИ С "А 0 002 фЧ ---г Я ф где Ч - общий объем образца гидролиэата (обычно 11,2 мл),мл,С - объем стандартного декстрозного раствора, применяемого для титрования контрольной смеси, мл,А - объем стандартного декстроэного раствора, применяемого для титрования образцагидролиэата, мл,Я - масса фермента на 1 мл разбавленного ферментногораствора.Активность иммобилизированной иэо"меразы.Активность иммобилизированной изомеразы определяют согласно следующейметодики,Образец имиобилизированной изомеразы, содержащий 1400-2200 1 СТИ,взвешивают. Этот образец промывают в250-миллиметровой колбе 125 мл декстроэного раствора (предварительнонагретого до 65 фС) и 10 мл О,1 Мраствора трис-(гидроксиметил) аминометана (ТНАМ) с рВ 7,8, Образец декстрозного раствора содержит 3,33 Мдекстрозы, 20 мИ сульфата магния,10 мИ сульфита натрия, 100 мМ ТНАМ и1 иИ хлорида кобальта (рН 7,8). При(Ка - К )а Ы С 1 4555 50 5 10 15 20 25 30 35 40 65 фС этот раствор имеет рН около 7,0, Колбу помещают на водяную баню при 65 С и встряхивают в течение 1 ч, Смесь затем отфильтровывают в вакууме через 45-миллиметровую грубую керамическую воронку, набитую стекловолокном, предварительно покрытым 1 г ускорителя фильтрования. Колбу и фермент Промывают небольшой аликвотой по 100 мл 100 мМ буферного раствора ТНАМ (рН 7,6).Промытый фермент переносят в 250- миллиметровую колбу, содержащую 125 ил раствора декстрозы (предварительно нагретого до 65 С). Промытый фермент затем количественно проиывают внутри колбы 10 мл 1 О мМ раствора ТНАМ буфера (рН 7,8), после чего колбу встряхивают 60 мин. Затем добавляют 12,0 мл ледяной уксусной кислоты и подкисленный раствор встряхивают еще 15 мин. Смесь отфильтровывают под вакуумом через 45-миллиметровый керамический фильтр со стекловолокном, покрытым предварительно 1 г ускорителя фильтрования. Колбу и содержимое воронки промывают деминерализованной водой до тех пор, пока не соберут около 400 мл фильтрата. Фильтрат охлаждают до 25 С и разбавляют до 500 мл. Оптическое вращение раствора определяют в 2-дециметровой кювете при 25 С и обозначают К. Холостой опыт проводят аналогичным образом за исключением того, что не добавляют фермента. Оптическое вращение в холостом опыте определяют также при 25 С и обозначают как К. Степень изомеризации рассчитывают с помощью следующего соотношения где с( - изменение удельного вращения, когда фруктоза полностью превращается в декстрозу,Ср - концентрация сахара в растворе (0,15 г/мл),1 - длина поляриметрическойтрубки (2 дм).Фиксированные единицы активности(ГАИ) изомеразы рассчитывают следующим образомРАИ/г = 1 С/Кр 11,где К - константа скорости реакции (1,21 1 ч " ГАИ мг глюкозы),50где Г Т 11- время реакции, ч (1 ч),11 - масса образца, г,С - начальная концентрация на125 мл реакционной смеси ю дд ( й + д) + дг( й д) К К Е С е Кгде д - степень иэомеризации1 моля фруктозы при равновесии (0,513)ф,д - степень изомеризации в молярной фракции фруктозы,С, - начальная молярная концентрация глюкозы (3,33 М)ВК - константа Михаэлиса для5глюкозы (О, 7 М)К - константа Михаэлиса дляфруктозы (1,43 М).Одна ИСТИ равна 15,8 РАИ.ДСДИ - зто сокращение Международной Единицы Глюкозной Изомераэы исоставляет количество фермента, которое превратит 1 микромоль глюкозыво фруктозу в 1 мин в растворе, предварительно содержащем 2 моль глюкозыв 1 л, 0,02 моль сульфата магния и0,001 моль хлорида кобальта в 1 лраствора при рН 6,84-6,85 (0,2 Ммалеат натрия) и при 60 С. Определение глюкозной изомеразы осуществляют с помощью способа, описанногоЯ.Е.Ллойдом и др. в журнале СегеадСелеш, 49, У 5, стр. 544-553 (1972).Определение сахаридов.Анализы гидролизатов глюкозы,фруктозы, мальтозы и других сахаридов осуществляют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления. Методика описана в ЗСапйагйАпадуСсад МейЬойз, Согп Кейпегф вАааосг.аТ 1 оп, дпс, МеЬой Е.Степень иэомеризации (7. фруктозы).Процент фруктозы, получаемый врезультате изомериэации, определяютследующим образом.Аликвоту в 5 мл субстрата (неочищенного гидролиэата до его изомеризации) переносят пипеткой в 100-миллиметровую мерную колбу и разбавляют деионизированной водой до концентрации около 2,5 г сухго веще"ства в 100 мл раствора. Аликвоту в5 мл жидкости, вытекающей иэ колонны,содержащей иммобилиэованнуюглюкозную изомераэу, через которую протекает субстрат, также разбавляют деионизированной водой. Для разбав 12ленных субстратов и стока из колонныопределяют оптическое вращение.Константу (К) вычисляют следующимобразом где Й - разбавление = 20,д - длина поляриметрическойкюветы0,2000 дм,20 Г 1 ГО Ы 1 изменение удельного вращения при превращениичистой глюкозы в чистуюфруктоэу, измеренное с25помощью ртутной лампы,эта величина равна169,3,К = 59,08.Отсюда 7 фруктозы в сухом весе59,08(оз-ы)/С)где с - наблюдаемое вращение субстрата,- наблюдаемое вращение стокаиэ колонныС - количество сухого вещества35 в 1 мл субстрата, г.Определение стабильности глюкозной иэомераэы.Определение скорости реакции (К)и периода полураспада фермента (Й).Стабильность или период полураспада фермента реакций изомериэацииопределяли соответствующим уравнеФнием степень иэомеризации впоступающем в реактор потоке,Г/(Р + С) масса Фракции фруктозы врасчете на общую массу сухого углеворного субстрата,масса фракции глюкозы в расчете на общую массу сухогоуглеводного субстрата;степень иэомеризации в выходящем иэ реактора стоке,Г/(Г/С);13 14490141 - величина 1 при равновесии,0,514 при 65 С при 0,505 гри60 С,К - константа скорости начальной- -1, 5реакции, г (Р+С) ч ЕСЕИЕС - активность фермента, 16 ЕИ;С - концентрация субстрата, глюкоза, г/мл, .К - скорость отока, мл/ч,10с - период пол;распада фермента, ч;- время работы реактора, ч.Величины К- константу скоростиначальной реакции и величину с можнорассчитать, преобразуя вышеуказанноеуравнение в следующую форму;е Е, К. Ег я В =.) = 1 оц- 0,30102 с/й е Здвис ьмость графика логарифмаЕ, - Е 1К 1 п( в "-) относительно времениЕе Еравно -0,30102/ следовате.тьцо величина с. = 0,.10102/цдклоц, 11 нтерполируя вц и ццу (Х ) по времени О, из графика можне получить1,Еп (-." )Е - Е д.гцги скорост 1)едкц Тц.1 а. оором,С 1 О1Гг. Вели чина начал:,цой скорости реакции (1: ) и фдктор, выражающий период полураспада фермента (с), обеспечивают подходящее указание общей эффективности всего процесса. Чем выше значение, получаемое для Ктем больше эффективцость всего процесса в термиах скорости превращения глекозы во фруктозу н воздействе всего процесса ца период полураспада применяемого фермецтд.1 р и м е р 1. лнстрирует предлагаемый способ в непрерывном режиме, Показана высокая стдбильность глюкоизомеразы, которая достигается при осуще.твлении пред.дгаемого способа, Глюкоизоыераза, использованная в этом и последующих примерах, иммобилизирована ца ЕЛЕ целлюлозе.Зерновой крахмал, выделенный иэ зерна при мокром помоле, промывают деионизированной водой и получают таким образом пульпу с содержанием 15 20 25 30 35 40 45 50 сухого вещества крахмала 337, р 11 пульпы доводят до 5,2 добавлением МВО и достаточного количества амилазы (Теппашу 1-601.), чтобы создать активностьо -амилазы на 1 гсухого крахмала 7 ед. Пульпу помещают в змеевик из нержавеющей стали ои выдерживают при 86 С в течение 2,5 ч, После этой первой стадии термообработки пульпу перекачивают вдругой змеевик при температуре в оинтервале 115-130 С и давлении 3,57,0 кг/см в течение приблизительно1 мин, Затем пульпу охлаждают до темопературь приблизительно 36 С, добавляют такое же количество О -амилазы,как и на первой стадии термообработки, и цдпрдвляот пульпу на третьюстадию термообработки. В этом зме"евике, хдрдктеристики которого совпадают с характеристиками первогозмеевика, пульпу выдерживают приО86 С в течение 2 ч.Ожижецый крахмал разбавляют досодержания твердого вещества 307 деноизровдной водой и подвергаютосдхдрв;ццо в многоступенчатой системе реакторов, представляющих собойре .рвуары с мешалками. Лобавляют уск р те.чь фильтрования (Е 1 са 1.сеС, СКЕГСО, ЕИС) в количествй1, :д сухое вещество, и зате;тоиодятр 1 Г цо 4,5 добавлением ВС 1. Ожи;,еццыйкр;хмальцый состав помещдот ц первый реактор ц реакшоой системе,добавляют достатокое количест оглюкодмилдзы (А 0-150, ВдсЬ 51 3075,Хочо Епгутпе Согр.) с тем, чтобы концентрация едиш:ц глюкодмлазы (СИ)составляла 0,27 ца 1 г сухого крахмала. Содержимое реактора нагреваютодо 58 С и затем порциями пропускаютчерез семь дополнительных ре;кторовпри той же гемцердтуре. Сред ее времяпребывания в кдж том реакторе составляет 7,5 ч. В конце иклд осдхдривания проду;т 1 едкции илн раствор пропускают через Аильгр, предвдри гельнопокрытый ускорителем фильтрованияпри пониженном давлении, 254 мм рт.ст,для удаления любых присутствующих некрахмальцых остатков,1 ля получения вещества, пригодного для изомеризации с глюкозоизомеразой, раствор концентрируют до содержания сухого вещества приблизи- тельно 507. в непрерывном испарителе.о Сцдчдлд раствор нагревают до 86 С19 14490 фильтровывают и фильтрат доводят до содержания М 8(НБО) 0,0025 М. рН этого субстрата доводят до 6,0 с помощью МяО, а затем до 7,8 с помощью ИаОН. Субстрат С готовят, растворяя5 достаточное количество кристаллической декстрозы в деионизированной воде, при этом получают раствор, содержащий 507. сухой декстрозы. Раст . вор доводят до содержания Мд(НБО) 0,0025 М и рН 6,0 с помощью МееО, а затем до рН 7,8 с помощью ХаОН. Т а б . и е, а 1 Влияние условий ожижения исостав сахаризованных субст Оо ахариваилратолусто:е т глюкозоизомера:ыубстра 11 оказ ате 1 ь 96,Глюкоза, Х сухой массы 96,6 Мальтоза, 7 сухоймассы Кетоза, молярноеотношение О,.(О,05 О5 Константа скорости,К ь О, О 25 Период полураспадафермеета,58; 470 7000 Эффективность фер+ мента,К 10,1 14,7 17,4 г (С+Г) 1 С 1 И чг (С+Р) 1 С 1 И с Оих температ;Еах З 1,Т;клаиное,1 Ия,т,е, при уело,О:х. гчо сязанЕых 5 о С ИСПОЛЬЗОВаОМ ,. .-Г .1 ЧЕНной из В,вееЬг 11 е., ".-", ., - ТЕ,1;.еакции изомсрз е;, .- , Оалис.мклистялличесь.еи ( " . роз КаОст -ве субстрата указ а .о, чтоэтОт матер 1 лНе бь".1 1;О 1" стьюсвободе. от веег,Е, Ода;:1 юшинактевность лю 1,РЭ и 3 омсразе итак 1 емобразом, позО ю; еще ра- подчеркЗатем субстраты подвергают изомеризации пропусканием их через стеклянные колонки, оборудованные Данные табл.З свидетельствуют о том, что наивысшая устойчивость фермето и эффективность конверсии достигается в том случае, когда неочищенньп субстрат содержит малое количество мальтулозы, Существенно более низкие значения для устойчивости и эффективности получаются при использовании неочищенного субстрата В, содержащего большее количество мальтулозы и приготовленного при более высоких значениях рН и вы 14 20рубашкой при 65 С. Каждая содержитоколо 800 1 С 1 И иммобилизованной глюкоизомеразы. Субстраты водят в колонки сверху вниз при скорости потока 0,3 мл/мин. Изомеризацию осуществляют непрерывноа протяжении 17дней. Ежедневно тбирают образцы субстратов и растворов, выходящих изколонки, с целью определения концентраций фруктозы и глюкозы в субстратах и вычистяют кинетическиепараметры реахИЕй изомеризации, Нисубстрат А, 1 и субстрат В не подвергаот процессам сч стки перед осуествУееИем изомеризаьли,Результагь приведены в таол. 3,