Штамм бактерий bacillus вrеvis продуцент рестриктазы в 12 i — SU 1694647 (original) (raw)
СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК С 12 й 9/14, 1/20 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ К АВТОРСКОМ ИДЕТЕЛЬСТВУ Дегтя- АфриИзобретение относитсгии и генной инженерии, вучению штамма, исполполучения сайт-специфичесзы рестрикции (рестриктазрасщепляющей последоватотидов 5 -6(А/Т)ОС(А/Т)С Рекстриктаза даннойможет быть использована днированию, физическому кнов, гидролиэат ДНК фагаВЬч 12 1 может служить удо хнолок поло для уклеащей и нуклея к биоте частности ьзуемог кой андо ы), узнаю ельность чности по клонию гектаэой рке ром ля работ артирова Л рестри бным ма ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ и Институтмикробиологии АН АрмССР(56) Матчецио И, РасЫс 1 поч О.МКгащагочЧ.М. ТЬе гесо 9 пй 1 оп зечцепсе о 1 зтезресНс епбопцс 1 еазе ВЬч1 гоа ВасцзВгеч 1 з 80. РЕВЯ 1 естегз, 1984, ЧЛ 77, р.23-26,Вговп И.1, Мс. С 1 еапб М., МЛйеЬеаб РЯ.Н 91 А 1: А. гезтгст 1 оп епбопцсеазе 1 говНегресоз 1 рЬоп 919 ап 1 ецз НР 1023, бепе, 1980, ч.9,р.49-68.В 1 сЫе Т,АР 1 гопа Ч 1 вЬег В. А зглр 1 е,9 епега 1 ргосебцге аког рцгОу 1 п 9 гез 1 гсТ 1 опепбопцс 1 еазез. - Йцсе 1 с Ас 1 бз, Вез, 1977,ч.4, М 8, р.2561 - 2572,Ц, 1694647 А 1(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ВАС. ОЯ ВЯЕчЯ- ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ ВЬч 12 1 (57) Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Цель изобретения - выявление штамма Вас 11 цз Ьгечз, синтезирующего рестриктазу ВЬч 12 1, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 - 6(А/Т) ОС (А/Т)С - 3 с более высоким выходом фермента. Предлагаемый штамм выделен в результате систематического поиска штаммов - продуцентов рестриктаз и хранится, во ВКПМ ВНИИгенетика под регистрационным номером В, Штамм продуцирует рестриктазу ВЬч 12 1, имеющую сайт узнавания, идентичный рестриктазе Н 91 А 1, и может полностью заменить известный во всех генно-инженерных работах. Преимуществом предлагаемого штамма является повышение выхода целевого фермента, вдвое большего чем у известного штамма. Выход фермента ВЬч 121 составляет 6000 ед./г сырой биомассы, Штамм неприхотлив к питательным средам. для определения молекулярных весов фрагментов ДНК. Данная рестриктаза является удобной моделью для излучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий. Известен штамм Вас 111 цз Ьгеч 1 з - праду цент рестриктазы ВЬч 11,Однако культивирование штамма тру доемко, выход рестриктазы составляет 667 ед/г сырой биомассыКроме того, ре стриктаза, продуцируемая этим штаммом не способна узнавать и расщеплять после5 10 20 25 названа 12 1 согласно общепринятой, номен клатуре.Штамм ВасИоз Ьгечз характеризуется 40 довательность нуклеотидов 5 - 6(А/Т) 6 С(А/Т) СЗ.Наиболее близким к предлагаемому является штамм - продуцент рестриктазы Нц А 1, узнающей и расщепляющей последовател ьность 56(А/Т)6 С(А/Т)С. Штамм выращивают на среде, содержащей 1% бактоказитон (О 1 со), 0,5%-ный дрожжевой экстракт. Культивирование осуществляют в термостатированных качалках при 30 С.Недостатками данного штамма (по литературным данным) являются низкий выход фермента, составляющий 3000 ед/г сырой биомассы, а также требовательность к богатым и дорогостоящим питательным средам (выход биомассы не указан). Цель изобретения - выявление штамма ВасИоз Ьгечз - продуцента, синтезирующего рестриктаэу ВЬч 121, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 56(А/Т)6 С(А/Т)Сс более высоким выходом фермента.Штамм выделен из бурой окультуренной почвы в результате систематического поиска штаммов - продуцентов эндонуклеаз рестрикции в роде ВэсИоз и хранится в ВКПМ под регистрационным номером В,Рестриктаза иэ ВасИоз Ьгечз Вследующими признаками.Кул ьтурал ьно-морфологические и ризнаки. На МПА и РА колонии кремовые, плоские, гладкие, блестящие. Клетки пэлочковидные, размеры: длины 1,6 - 2,5 и ширина 0,6 - 0,8 мкм. Образуют эндоспоры овальной формы, расположенные в основном центрально или парацентрально. Отмечается некоторое раздувание спорангия. Аэробы, температурный оптимум роста 27 - 30 С, растет при РН 7,0 - 9,0.Физиолого-биохимические свойства. Образует каталазу, протеазу, крахмал не гидролизует, ацетоинотрицательные, нитраты не восстанавливает, в 7%-ном йаС не растет, кислоту из глюкозы, арабинозы, ксилозы, маннита не образует, утилизирует цитрат. Из источников азота использует пептон и соли аммония.Предлагаемый штамм в отличие от известного хорошо растет в агаризованной питательной среде отечественного производства, приготовленной на основе 3,7 ф" гидролизата кильки.Биомасса легко лиэируется лиэоцином. Хранение штамма осуществляют подваэелиновым маслом или в 30%-ном глицерине при 70 С,45 50 55 Для глубиного культивирования ВасИ 1 оз Ьгеч 1 з Вприменяют питательную среду следующего состава, г/л;Рыбный гидролизат 37Вода ОстальноеКультивирование проводят при 30 С с хорошей аэрацией до достижения фазы замедления роста. Выход рестриктаэы ВЬч 12 1 6000 ед/г сы рой биомассы.Определяющие отличия предлагаемого штамма Вас 1 Иоз Ьгечз следующие:штамм содержит одну сайт-специфическую рестриктазу ВЬч 12 1 способную узнавать и расщеплять нуклеотидную последовательность 5-6(А/Т)6 С(А/Т)С:продуктивность штамма в 2 раза превосходит по целевому ферменту известный штамм,Предлагаемый штамм способен к культивированию в недорогой питательной среде отечественного производства,П р и м е. р; Культуру хранят в косяках под вазелиновым маслом. Перед началом работы клетки пересевают бактериологической петлей на твердую агаризованную среду (3,7% СПА).Чашки Петри помещают в термостат на 30 С,После 24-часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, состоящей из 3,7% гидролизата кильки, и помещают в термостат на ночь. Ночную культуру штамма ВасИ 1 оз Ьгеч 1 з засевают в жидкую питательную среду, состоящую иэ 3,7% рыбного гидролизата, остальное - вода, Культивируют в термостатированных качалках при температуре 30 С при 200 об/мин до достижения фазы замедления роста. Клетки осаждают центрифугированием при 4 С. Выделение осуществляют по известной методике ВсЫе, Ргопа 1 вЬег. Выход фермента составляет 6000 ед/г сырой биомассы. Фермент хранится при 20 С в глицерине.Полученный штамм обладает следующим преимуществами по сравнению с известным;содержит сайт-специфическую рестриктазу ВЬч 12 1 с высоким выходом фермента (6000 ед/г вместо 3000 ед/г у известного,Способен расти на простых недорогих отечественных средах.Поскольку рестриктаза ВЬч 12 1 имеет сайт узнавания, идентичный сайту узнавания Нс А 1, а выход фермента более высок, то ВЬч 12 1 может заменить известный во всех генно-инженерных работах.Ф о р мул а и зоб рете н ия Штамм бактерий ВасИ 1 оз Ьгеч 1 з ВКПМ В- продуцент рестриктаэы ВЬч 12 1,