Способ определения уровня мутаций при радионуклидном загрязнении — SU 1784139 (original) (raw)

.П и поли- и евронетика,мный подели евроГенетикаМ Ь ОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБ ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(56) Алтухов Ю.П. и др. Аллозимньморфизм в природной популяции епейской Рсеа аЬез (Е,) Кагз 1. - Г1986, т.22, М 8, с,2135 - 2151.Крутовский К,В, и др. Аллозииморфизм в природной популяциипейской Рсеа аЫез (Е.) Кагзт. -1986, т,22, М 9, с.2310 - 2316. Изобретение относится к лесному хозяйству и может быть использовано в области селекции и семеноводства для определения степени радиационного поражения семенного материала, а также в области радиационной генетики для оценки генетических последствий Чернобыльской аварии.Известен способ определении частоты мутаций с использованием эндоспермов ели европейской, заключающийся в гомогенизации эндоспермов, центрифугировании гомогенатов, внесении полученной надосадочной жидкости в полиакриламидный гель (далее по тексту ПААГ), проведении электрофореза и выявлении фракций фермента путем гистохимического скрашивания, с последующим учетом нетипичных вариантов, отсутствующих у исследуемого дерева,способа заклюьзовании ПААГ,Недостаток описанногочается, во-первых, в испол Я 2 1784139 А(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЙ УРОВНЯ МУТАЦИЙ ПРИ РАДИОНУКЛИДНОМ ЗАГРЯЗНЕНИИ(57) Использование: биотехнология, лесное хозяйство, радиобиология. Сущность изобретения: определяют уровень мутаций при радионуклидном заражении путем гомогенизации эндосперма семян ели европейской и электрофоретического разделения изоферментов эндосперма в крахмальном геле, после которого в полученном изоферментном спектре исследуют весь набор генов, кодирующих соответствующие изоферменты, и учет мутаций ведут только по генам, находящимся в гомозиготном состоянии,что не позволяет исследовать за один электрофоретический анализ более чем 1 - 2 ферментных системы; т.е; производительность данного способа мала, поскольку за один электрофоретический анализ исследуя 15 - 30 эндоспермов, получим только 30 - 60 локус-тестов, Это особенно существенно при исследованиях частоты возникновения мутаций, требующих десятков и сотен тысяч локустестов. К тому же для электрофореза в ПААГ гомогенат необходимо отцентрифугировать, что усложняет технологию исследования, Также немаловажным моментом является та особенность, что ПААГ зачастую вносит искажения во фракции изоферментов, Во-вторых, существенным недостатком описанного способа является включение в исследование генов, находящихся как в не- изменчивом (гомозиготном) состоянии так и в изменчивом (гетерозиготном) состоянии, что, в последнем случае, делает невозможным выявление таких мутационных собы.ъиЗаказ 4323 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород. ул,Гагарина, 101 тий, когда один вариант гена мутирует в другой вариант, встречающийся в норме у данного дерева. Принимая во внимание низкую частоту возникновения мутаций (10 - 10 6), неучет даже одного мутантного события сильно изменяет общую картину мутационного процесса.Цель изобретения состоит в повышении производительности и точности способа определения частоты мутаций в эндоспермах ели европейской при радионуклидном загрязнении.Это достигается тем, что с целью повышения производительности при электрофоретическом .исследовании применяется крахмальный гель, не требующий предварительного центрифугирования гомогената и не вносящий искажения во фракции иэоферментов, Крахмальный гель после одного электрофоретического анализа разрезается на 8-10 горизонтальных пластин и путем гистохимического окрашивания исследуется весь набор генов, кодирующих соответствующие 8-10 ферментных систем. Для повышения точности учет мутаций ведется только по генам, находящимся в гомозиготном состоянии у исследуемого дерева.Предлагаемый способ был опробиро. ван на семенном материале ели европейской, собранном в районах, подвергшихся радионуклидному загрязнению вследствие аварии на Чернобыльской АЭС, Эндоспермы освобождались от оболочки, гомогенизировались и без предварительного центрифугирования, на отдельную дорожку крахмального геля помещался гомогенат одного эндосперма. Поиск мутаций велся по генам, которые находились в гомозиготном состоянии у анализировавшихся деревьев.В этом случае, после электрофореза прй гистохимическом окрашивании выявляется ровный ряд фракций фермента и любой эндосперм, показавший отклонение отэтого электрофоретического.спектра, должен рассматриваться как мутантный по анализируемому гену, Известно, что большинствомутаций по структурному гену или изменяет электрофоретическую подвижность соответствующего фермента, или нарушает функцию гена, и тогда, иэ-за отсутствия генногопродукта, окрашенная фракция на гелевой5 пластине не появится (нуль-мутация), Приэлектрофоретическом анализе эндоспермов были найдены оба типа мутаций (фиг,1),Обнаружена нуль-мутация по гену алкогольдегидрогеназй (АОН), произошедшая у эн 10 досперма, расположенного на дорожке 8; вэтом образце полностью отсутствует продукт гена Аоп, Найдена мутация с изменением подвижности, произошедшая по генуглутаматдегидрогеназы (ООН). На спектре15 60 Н четко видна фракция с измененнойподвижностью, расположенная на дорожке2. По гену ОбЬ вариант 1,00 перешел в вариант 0,75. Следует подчеркнуть, что если быисследовалось дерево гетерозиготное по20 вариантам 1,00 и 0,75 глутаматдегидрогеназы, то такая мутация не могла бы быть уточнена.Использование предлагаемого изобретения позволяет существенно (в 4-6 раз)25 повысить производительность электрофоретического способа определения частотымутаций в эндоспермах ели европейской ипозволяет практически со 100 ф -ной точностью учитывать случаи мутаций,30Формула изобретенияСпособ определения уровня мутацийпри радионуклидном загрязнении, включающий гомогенизацию эндосперма семян35 ели европейской, внесение гомогената вгель-носитель, злектрофоретическое разделение изоферментов, гистохимическоеокрашивание для проявления электрофоретических спектров изоферментов, их ана 40 лиз и учет мутаций, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения точности и информативности исследования, в качестве носителя используют крахмальный гель, послепроявления спектров гель разрезают на 8 -45 10 пластин, исследуют весь набор генов,кодирующих соответствующие изоферменты, и учет мутаций ведут только по генам,находящимся в гомозиготном состоянии.

Смотреть

Способ определения уровня мутаций при радионуклидном загрязнении