Способ определения гистамина в би-ологическом материале — SU 845099 (original) (raw)
Союз СоветсннхСоцналнстнчесннхРеспублнк АНИЕ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 1) Дополнительное к авт 2) Заявлено 25.07.79 (2 вид-ву -(51) М К з б 01 МЗ 832576 28-13 явкис присоединение оударетееииык комитет) Авторы изобретен В минскии и В. А. Кузнецо Рижский медицинский институт 1) Заявител(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИСТАМИ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕбиохимии,ления гист ние относитс способам о Изобречастностимина. Гиста мин является одним из важнейших гуморальных биологических регуляторов - тканевых гормонов. Его непосредственное участие в процессах микроциркуляции и в аллергических реакциях обуславливает необходимость определения количества этого вещества- в различных экспериментальных условиях и при клинической диагностике.Известен способ определения гистамина в биологическом материале 11, который осуществляется следующим образом.Из депротеинизированного образца, готовят две аликвоты, содержащие гистамин, для опытной и холостой проб. К 1 мл опытной пробы прибавляют последовательно 0,2 мл 1 н,раствора едкого натра; 0,15 мл 0,2%-ного раствора ортофталевого альде. гида в метаноле и 0,15 мл 3 н. раствора соляной кислоты. К 1 мл холостой пробы прибавляют те же реактивы, но в обратном порядке - 0,15 мл 3 н, раствора соляной кислоты, 0,15 мл 0,2%-ного раствора ортофталевого альдегида в метаноле и 0,2 мл 1 н, раствора едкого натра. Такой порядок прибавления реактивов в холостой пробе объясняется стремлением создат .условия, при которых не будет происходить образование флуоресцирующего продукта конденсации гистамина и ортофталевого альдегида. Далее, из величины флуоресценции опытной пробы вычитают величину флу.оресценции холостой пробы и полученный результат используют для определения по калиоровочному графику концентрации е гистамина в образце. Изменение данного(обратного) порядка внесения реактивов в опытную и холостую пробы невозможно, так как не позволяет учесть интенсивность флуоресценции реактивов и исключает про-.ведение исследования.При определении флуоресценции калибровочных растворов стандартов гистамина в концентрации 0,1 мкг/мл получают 100 ед.флуоресценции, для 0,002 мкг/мл - 3 сд.флуоресценции.График, построенный по этим и иромет жуточным значениям, проходит черезось ординат на уровне 1 - 3 единиц шкалы.Следовательно, ошибка определения концентрации гистамина в биологическом ма845099меряют флуоресценцию опытной и контрольной проб с помощью спектрофлуориметра при длине волны возбуждения 360+.2,86 нм и длине волны флуоресценции 440+2,86 нм.По разнице флуоресценции опытной и контрольной проб определяют концентрацию гистамина в образце с помощью калибровочного графика.При апробации данного способа проведено 51 экспериментальное исследование по определению флуоресценции калибровоч 10 ных растворов стандартов гистамина вконцентрации 0,002 - 0,5 мкг/мл в образцах крови морских свинок. Ошибка определения составила 2/о При этом значение флуоресценции холостых проб отличалось хорошей воспроизводимостью - процент расхождения параллельных проб 15 - 17%.15Проведено 71 клиническое исследованиегистамина в образцах крови здоровых лиц и больных различными заболеваниями, при этом проводили сравнение двух методик (прототип и данный способ) с характеристикой их ошибки, Ошибка определения содержания гистамина в биологическом материале, проведенного по прототипу в сравнении с предлагаемым способом, составила 25-30.Приведенные данные показывают, чтопредлагаемый способ определения гистамина в биологическом материале ввиду высокой точности и простоты выполнения может быть широко применен в практике биохимических исследований в клинике. Формула изобретения териале может равняться 50 - 60%. Раз брос величин обусловлен непостоянством случайным характером значений флуорес ценции холостых проб.Выполнение анализов большого коли чества образцов добавлением реактивов в двух взаимно противоположных последо вательностях снижает точность исследова ния и в значительной степени затрудняет ра боту.Целью изобретения является повышение точности способа.Поставленная цель достигается тем, что в известном способе определения гистамина в биологическом материале путем последо вательного добавления к нему едкого нат ра, раствора ортофталевого альдегида в ме таноле и соляной кислоты, измерен 14 я флуо ресценции пробы и сравнения полученных данных с контролем, к контрольной пробе предварительно добавляют 0,05 - 0,07 мл 33%-ного раствора перекиси водорода.Способ осуществляется следующим образом.4 мл крови собирают при температуре +4 С в полиэтиленовую пробирку, содержащую 1 мл 0,6%-ного раствора двунатриевой соли ЭДТА и 35 мг аскорбиновой кислоты. Добавляют 5 мл охлажденного 1 м раствора хлорной кислоты с аскорбиновой кислотой (7 мг/мл). Интенсивно встряхивают. Смесь центрифугируют при температуре +4 С при 2000 о, в течение 30 мии. К полученному супернатанту прибавляют 0,25 мл 5 и едкого натра; 1,5 г хлористого натрия и 10 мл н-бутанола. Раствор встряхивают 5 мин и центрифугируют при 500 в течение 3 мин, Бутанольную фазу с экстрагированным гистамином переносят в пробирку с 3 мл 0,1 н раствора соляной, кисло ты и 8 мл гептана, Смесь встряхивают 5 мин. Центрифугируют при 500 у в течение 3 мин. Кмл кислотной фазы, содержащей гистамин (опытная проба), добавляют 0,2 мл 1 н раствора едкого натра и 0,15 мл 0,2%-ного раствора ортофталевого альдегида в ме таноле. Через 4 мин добавляют 0,15 мл 3 н. раствора соляной кислоты. К 1 мл кислотной фазы, содержащей гистамины (контрольная проба), дббавляют 0,06 мл 33%-ного раствора перекиси водорода и перемеши вают раствор. Затем прибавляют 0,2 мл 1 н, раствора едкого натра, 0,15 мл 0,2%-ного раствора ортофталевого альдегида в метаноле и 0,15 мл 3 н. раствора соляной кислоты. Не позднее, чем через 30 мин, изСпособ определения гистамина в биологическом материале путем последовательного добавления к нему едкого натра, раствора ортофталево го альдегида в метаноле и соляной кислоты, измерения флуоресценции пробы и сравнения полученных данных с контролем, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, к контрольной пробе предварительно добавляют 0,05 - 0,07 мл 33%-ного раствора псрекиси водорода. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Р.А. Юоге. Н 1 е СЬеписа Ре 1 еггппагоп о 1 АЫапцпе ЙегЬедз о 1 Вос 1 егпса апа 1 уз 3. Апа 1 уз 3 о 1 Водепс апцпез апд %е 3 Кеахмед Епгупез муррегпеп 1, 1 гоигпе, ,птегзсепсе Рцйзп., 1971, р. 89 - 97.Составитель О. Ленчицкая Редактор Н. Потапова Техред А. Войкас Корректор Г.Назарова Заказ 4136/2 Тираж 907 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4