Способ твердофазного синтеза олигонуклеотидов — SU 1318600 (original) (raw)
131860Изобретение относится к биоорганической химии и биотехнологии иможет быть использовано для твердофазного синтеза олигонуклеотидовкак в ручном, так и в автоматизирован ном варианте./Цель изобретения - повышение выхода олигонуклеотидов, ускорение иупрощение технологии, что достигается использованием в твердофазном син- Ютезе носителей на основе целлюлозныхтканей.П р и м е р 1. Приготавливают образцы целлюлозных тканей: из хлопчатобумажного полотна - диски диаметром 1 см и отрезок ленты размером1 х 1 см, края которых фиксируют полиэтиленом, из льняного полотна (содержащего около ЗОБ лавсана) - дискидиаметром 1 см, края которых фиксиру ют полиэтиленом, и отрезок нити длиной около 3 см, Часть хлопчатобумажных и льняных дисков обрабатываютконцентрированным аммиаком (используют препарат концентрации 25-287.) втечение 3 ч,промывают водой (4 х 15 мл),ацетоном (Зх 15 мл) и высушивают навоздухе в течение ночи. К подготов"леиньш образцам целлюлозных тканей(Зх 10 мл) и прибавляют 1 мл абс, пиридина и 136 мг (0,45 ммоль) 2,4,6 триизопропилбензолсульфонилхлорида,Через 1 ч диски промывают пиридином(4 х 10 мл), прибавляют 0,2 мл1-метилимидазола, смесь упаривают с 40абс. пиридином (Зх 10 мл), прибавляют0,4 мл свежеперегнанного уксусногоангидрида и 2 мл абс. пиридина. Через 20 мин диски промывают пиридином(4-10 мл), хлороформом (Зх 10 мл) 45пентаном (Зх 10 мл) и высушивают навоздухе,Нагрузку первого нуклеозида определяют спектрофотометрически по количеству диметокситритилкарбинола 50( Ь = 71700 в смеси хлорная кислотаэтанол 3:2).Количество первого нуклеозида (нагрузка) на носителе на основе целлюлозных тканей представлено в таблице. 55П р и м е р 2. Два диска (один -.из бумаги "Ватман - ЗИМ", другой - изхлопчатобумажной ткани), содержащиев качестве первого нуклеозида 5 -00 2диметокситритил,6-бензоил-аденозин, помещают в реактор колоночного типа установки для автоматического синтеза олигонуклеотндов и проводят автоматизированный синтез олигодезоксирибонуклеонтида д(ТСАТТТТТСТАТАСАААТТА). Удаление диметокситритнльной защитной группы и все промывки носителей осуществляют автоматически, раствор нуклеотидного компонента и конденсирующего реагента в абс. пиридине подают в реактор с помощью шприца,После проведения последней стадии конденсациипромывок и удаления диметокситритильной защитной группы диски (каждый отдельно) обрабатывают 1,5 мл 0,5 И раствора п-нитробензальдоксимата лития (пиридин-вода 8:2) в течение 20 ч, растворитель упаривают на ротационном испарителе и диски обрабатывают в 10 мл концентрированного аммиака в течение 20 чопри 45 С. Раствор отфильтровывают, диски промывают водой (2 х 5 мл), объединенные Фильтраты упаривают до поло- . вины объема. Органические примеси экстрагируют хлороформом (2 х 5 ил), водную фракцию упаривают досуха. Реакционную смесь обессоливают на колонке с биогелем Р Целевой олигонуклеотид выделяют методом анионообменной ВЗЖХ в градиенте калий"Фосфатного буфера, Выход олигодезоксирибо- нуклеотида й(ТСАТТТТТСТАТАСАААТТА) в расчете на первый нуклеозид составляет 0,67 для носителя на основе бумаги "Ватман-ЗИМ" (известный способ) и 1,63 для носителя на основе хлопчатобумажной ткани.Как видно из таблицы, предварительная активация целлюлозной ткани концентрированным аммиаком приводит к значительному увеличению нагрузки первого нуклеозида (в 1,8 раза для льняных и в 5 раз для хлопчатобумажных)Уменьшение концентрации аммиака в 2 раза (например, использование смеси пиридин - концентрированный аммиак 1:1) дает аналогичные результаты. При этом носители на основе целлюлозных тканей в отличие от бумажных после активации и введения первого нуклеозида не разбухают и сохраняют высокую прочность (механическую стабильность)П р и м е р 3, Диски из бумагиКоличество первого нуклеозида,связанного с носителем, мкмоль/г Образец носителя Неактивированныйноситель Акт ивиров анный концентрированньв БНАМОН носи- тель Хлопчатобумажнаятканьдиск 208 42 отрезок ленты Льняная ткань 148 83 диск 65 отрезок ленты ВНИИПИ Заказ 2479/22 Тираж 347 Подписное Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 3 13186 5-0-диметок ситритилтимидин, помещают в реактор установки и проводят удаление диметокситритильной защитной группы с помощью 37.-ной трихлоруксусной кислоты в хлороформе (контроль визуальный до исчезновения окраски диметокситритилкатиона) и последующую промывку хлороформом до нейтральной реакции элюата (контроль по индикатор" ной бумаге через каждые 1-1,5 мин 10 промывки). Определяют время, необходимое для завершения этих операций;время полного детритилирования составляет 5-7 мин для бумажных дисков и 3-4,5 мин для дисков иэ ткани, а 15 время полной отмывки кислоты хлороформом составляет 6-8 мин для бумажных дисков и 4-6 мин для дисков из ткани.Таким образом, в результате сопоставления предлагаемого способа 20 твердофаэного синтеза олгонуклеотидов с известным способом подтверждается (пример 1) возможность достижения высокой нагрузки первого нуклеоэнда на целлюлозных тканях (сравниваемой с нагрузкой на бумажных дисках в известном способе) с помощью предварительной щелочной активации и последующего присоединения первого нуклеозида. Кроме того, в многоста дийном олигонуклеотидном синтезе (пример 2) при абсолютно одинаковых реакционных условиях во всех синтетических операциях выход конечного 00 4продукта (20-мера) на носителе из целлюлозной ткани более чем в 2,5 раза превышает выход, полученный на бумажном диске. При этом диски иэ целлюлозных тканей (пример 3) промывают растворителями от реагентов в 1,5-2 раза быстрее, чем диски из бумаги,формула и э о б р е т е н и я 1.Способ твердофазного синтеза олигонуклеотидов, включающий модификацию сегментного носителя на основе целлюлозы путем присоединения первого нуклеозида с помощью защищенного нуклеозид-0-сукцината и последующее наращивание олигонуклеотидной цепи защищенными нуклеотидными блоками в присутствии конденсирующего реагента, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода олигонуклеотидов, ускорения и упрощения процесса, в качестве носителя используют носитель на основе целлюлозных тканей, предварительно активированный щелочной обработкой. 2.Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что щелочную обработку осуществляют концентрированным водньи аммиаком или смесью пиридинконцентрированный водный аммиак (1:1 по объему).