Штамм бактерий еsснеriснiа coli продуцент нейтральной протеиназы — SU 1390241 (original) (raw)

СОЮЗ СОВЕТСНИКСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК ащЯО а, 9024 1 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯМ АВТОРСМОМУ СВИДЕТЕЛ СТВУЙ Ь(71) Институтцитологии АН СССР(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ЕЯСНЕК 1 СНХА СО 1 1 - ПРОДУЦЕНТ НЕЙТРАЛЬНОЙ ПРОТЕИ- НАЗЫ(57) Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новыйштамм бактерий ЕзсЬегсМа со 1ВКПМ В. Цель изобретения - получение нового штамма - продуцентанейтральной протеиназы, специфически расщепляющей актин. Бактерии выращивают на средах, приготовленныхна основе мясного настоя или экстракта. Максимальная протеолитическаяактивность достигается через 4-5 суток. Полученный фермент расщепляетактин с образованием только одногостабильного фрагмента с молекулярной массой 36 кД, Другие белки этимферментом не расщепляются.Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой штамм бактерий Езсйег 1 с 1 г 1 а со 1 г ВКПМВ.Цель изобретения - получение нового штамма - продуцента протениазы, специфически расщепляющей актин.Протеиназа, полученная из штамма ЕзсЬег 1 сйа со 1 г ВК 121 В, рас щепляет актин с образованием только одного фрагмента, не подвергающегося дальнейшему расщеплению. Другие белки эта протеиназа не расщепляет.Штамм Евсйег 1 сМа со 1 ВКПМ 3-3697 выделен из раствора, применяемого для выделения актина, на биостанции "Восток" Института биологии моря Дальневосточного научного центра АН СССР. 20Штамм имеет следующую характеристику.На различных средах штамм образу,ет палочковидные клетки, располагающиеся поодиночно или в коротких 25 цепочках. Палочка подвижна, имеет капсулу. Клетки грамотрицательны. Клетки растут на плотных и жидких средах, приготовленных на основе мясного настоя или экстракта, Темпераотурный оптимум - 37 С, растут при 22 , при 4 и 40 С роста нет.Сохраняет жизнеспособность и фер" ментативную активность при храненииопри 4 С. Разлагает глюкозу с образованием кислоты и газа, индол и сероводород не образует.ферментирует мальтозу, маннит, сахарозу, сорбит, ксилозу, крахмал,Не разлагает дульцит, лактозу, рам нозу, инозит, адонит, салицин, моче- вину. Образует каталазу. Превращает нитраты в нитриты. Не патогенен.45Культивирование клеток ЕзсйегдсЬда со 11 ВКПМ Впроводят в колбахо емкостью 250-500 мл при 28 и 37 С в течение 2-7 сут. Среда для культивирования: триптический перевар бычьего сердца, плацентарный бульон (настой плаценты) или аминопептид, рН 7,0-7,2. В течение суток культура находится в логарифмической фазе роста, затем выходит на стационарную фазу. Конец культивирования определяют по максимуму эндогенной фермента- . тивной активности, который достигается на 4-5 сут роста. Ферментативную активность определяют по перевариванию актина. Бактерии разрушают ультразвуком или несколькими циклами замораживания -размораживания. Клеточный экстрактосветляют центрифугированием и добавляют к раствору актина. Смесь иноубируют при 20 С и подвергают элект"рофорезу в полиакриламидном геле вприсутствии додецилсульфата натрия,0 величине ферментативной активностисудят по интенсивности зоны на геле,соответствующей стабильному фрагменту актина с мол. массой 36 кД.П р и м е р 1. Для выращиваниябактерий в колбу емкостью 500 мл,содержащую 250 мл настоя плаценты,вносят инокулят - суточную культуруЕ.со 1 д (А) ВКПМ Вр выросшуюна той же среде, из расчета 1 млкультуры на 100 мл свежей среды. Культивирование проводят в термостатепри 37 С в течение 5 дней,Ежедневно из колбы отбирают 10 млбактериальной культуры для определения количества клеток и ферментативной активности, О количестве бактерий в отобранных пробах судят по оптической плотности суспенэии приЯ ==600 нм, количеству колоний, выросшихи;, твердой среде, и концентрации об"щего белка в бактериальном экстракте.Для определения ферментативнойактивности клетки осаждают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20 мин, суспендируют в 3 мл раствора для экстракции актина (0,5 мМАТФ, 0,2 мМ СаС 1 , рН 7,5) и разрушают 3 циклами замораживания - размораживания, Полученный экстракт осветляют центрифугированием при 12000 об//мин в течение 40 мин,К 1 мл раствора, содержащего актин, с концентрацией общего белка1 мг/мл добавляют равный объем бактериального экстракта с концентрациейобщего белка 1 мг/мл. Смесь инкубиоруют при 20 С в течение 1 ч и анализируют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. На электрофореграмме видно, что исходный препарат актина содержит одну белковуюзону, После добавления бактериального экстракта интенсивность этой зоныуменьшается, и в препарате появляетсявторая зона, соответствующая фрагменту. актина мол, массой 36 кД. Количе1390241 из ЕзсЬег 1 сЬда со 11 ВКПМ В мл бактериального экстракта, полученного по примеру 1, с концентрацией белка 1 мг/мл инкубируют с 1 мп разведенных в воде до концентрации 1 мг/мл следующих белков: казеин, альбумин, овальбумин, лизоцим, РНКаза, гистон Н 2 В, тропомиозин, тропонины, С, 1 и 11 смеси инкубируют в течение 1 чо о при 20 С и в течение 1 сут при 4 С. Результаты реакции анализируют электрофоретически. В то время, как актин за 1 ч инкубации при 20 С полностьюопревращается во фрагмент с мол.массой 36 кД, другие белки не расщепляются. Это означает, что актин является единственным субстратом протеиназы А.ство фрагмента при добавлении экст" ракта 1-суточной культуры 207 от количества актина. Экстракт 2-суточной культуры расщепляет 503 исходного актина. Полностью актин превращается во фрагмент при добавлении экстракта 4-суточной бактериальной культуры,Таким образом, бактерии штамма ЕзсЬегдсй 1 а со 11 ВКПМ Всинтезируют расщепляющую актин протеиназу на стационарной фазе роста культуры..П р и и е р 2. Дпя получения фрагмента актина и определения его стабильности инкубацию актина с бактериальным экстрактом иэ 4-суточной культуры (как описано в примере 1) проводят в течение разных промежутков времени (от 40 мин до 24 ч). Продукты протеолиза так же, как в примере 1, анализируют электрофоретически.На электрофореграмме видно, что при всех сроках инкубации образуется только один фрагмент актина с мол. массой 36 кД. Дополнительных зон при 25 увеличении времени инкубации не образуется. Количество фрагмента при увеличении срока инкубации не уменьшается. Это означает, что фрагмент стабилен и не деградирует на фрагменО ты меньшей молекулярной массы.Таким образом, при инкубации актина с протеиназой из бактериального штамма ЕасйегсЬда со 11 ВКПМ Вобразуется один фрагмент актина, не подвергающийся дальнейшему протеолизу.П р и м е р 3. Для определения субстратной специфичности протеиназы Таким образом, штамм ЕзсЬегхсЬа со 1 х ВКПМ Вявляется продуцентом протеиназы, специфически расщепляющей один из основных белков мьшщ и цитоскелета актин с образованием стабильного фрагмента с мол.массой 36 кД, что позволяет использовать этот штамм для получения протеиназы - удобного инструмента для определения структуры актина и его свойств в составе сократительного аппарата клетки,Формула изобретения Штамм бактерий ЕзсЬегсМа со 1 дВКПМ В- продуцент нейтральнойпротеиназы. Составитель Т.Мелентьева Редактор Н.Гунько Техред М.Ходанич Корректор А.ЗимокосовЗаказ 1736/28 Тираж 520 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР пр делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж Раушская наб д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Смотреть

Штамм бактерий еsснеriснiа coli продуцент нейтральной протеиназы