Способ выделения и очистки бактериальной эндонуклеазы из культуральной жидкости sеrrатiа маrсеsсеus — SU 1392902 (original) (raw)

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИРЕСПУБЛИН 1392902 19) 1)5 С 12 Н 9/22 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Институт элементоорганических соединений им. А. Н. Несмеянова (72) Г, Е, Банникова, В. П. Варламов и С. В. Рогожин(56) филимонова Н. М., Баратова Л. А Воспельникова Н. Д., Желтова А. О. и Лещинская И. Б, Эндонуклеаза Б. аагсеввепв. Характеристика фермента. Биохимия, 1981, 4 Ь, 16 Ь 0-1667,Варламов В. П Лопатин С. А. и Рогожин С, В. Лигандообменная хроматография ферментов, 1, Синтез хелатных сорбентов и очистка экэонуклеазы А 5 актиномицетов. Биоорганическая химия, 1984, 0,927-934.Авторское свидетельство СССР У 1146321, кл, С 12 Б 9/22, 1983.(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ ИЗ КУЛЬТУ- РАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ БЕККАТ 1 А МАКСЕБСЕЧБ (57) Изобретение относится к области получения ферментов, в частности внеклеточной бактериальной зндонуклеазы. Целью изобретения является сокращение длительности процесса, повышение выхода и чистоты целевого продукта, Эндонуклеазу выделяют непосредственно из культуральной жидкости эа одну стадию с помощью лигандообменной хроматографии на хелатных сорбентах, содержащих группировки иминодиуксусной кислоты,т+заряженными ионами Со , Сорбцию эндонуклеазы проводят на колонке или в объеме, После промывки хелатного сор-рр бента исходным буфером 0,1 М Ма-аце- %Ф фтатным с рН 6,5-6,6, содержащим 0,3- С 0,5 М ВаС 1, эндонуклеазу десорбируют с выходом 65-953 тем же буфером, но с рН 4,7-5,0.табл./СН СОО ьСц 25 35 1 3929Изобретение относится к области получения ферментов, в частности внеклеточной бактериальной эндонуклеаэы. Эндонуклеаза применяется в молекуляр 5 ной биологии, биоорганической химии, а также в ветеринарии.Целью изобретения является сокра" щение длительности процесса, повы" шение выхода и чистоты целевого про дукта. Эндонуклеазу выделяют из культуральной жидкости ВКПМВза одну стадию с помощью лигандообменной хроматографии на хелатных сорбентах, содержащих группировки иминодиуксус ной кислоты (ИДК), ааряженные ионами1 еСц . Получение таких сорбентов описано в работе, Общая формула где Р - органический носительи СВз Со 30/Р -О(СЯ) -О-СН-СН-СИ -М Ою,СН СОО где Р - неорганический носитель.Метод лигандообменной хроматогра" фни основан на способности белков образовать комплексы с ионами переходных металлов, В процессе комплексообразования участвуют некоторые функциональные группы аминокислотных остатков поверхности белков, преимущественно имидаэольные и тиольные. Стационарная фаза представляет собой хелатные сорбенты, заряженные ионами переходных металлов; которые взаимодействуют с разделяемыми соединениями путем образования координационных связей, В отличие от других видов хроматографии в этом процессе сорбция белков может происходить в присутствии высоких концентраций солей, неионных детергентов н некоторых органических растворителей, что позволяет выделять фермент непосредственно из культуральной жидкости.Оказалось, что при рН Ь,5-6,6 из культуральной жиикости сервируется преимущественно эндонуклеаэа, а прочие белки остаются в растворе. Поэто" му при выделении фермента рН культу- ральной жидкости доводят до 6,5-6,6.Сорбцию эндонуклеаэы на хелатном сорбенте проводят на колонке с соотношением белок:сорбент 6 ед.А :1 см при скорости 15-20 мл/ч илн в объеме с соотношением белок:сорбент 0-12 ед,йА, :1 см , После промывки хелатного сорбента исходным буфером 0,1 М Яаацетатным с рН 6,5-6,6, содержащим 0,3-0,5 М ОаС 1, эндонуклеаэу десорбируют с выходом 65-953 тем же буфе" ром, но с рН 4,7-5,0. Наличие в используемых буферах 0,3-0,5 М ЮаС 1 обеспечивает подавление ионообменных взаимодействий. Использование более высоких концентраций МаС 1 нецелесообразно.П р и м е р 1. К 3 мл ИДК-агароэы (29 мкмолей/мл), заряженной ионами Сц и промытой 0,1 М Яа-ацетатным буфером рН 6,5, содержащим 0,5 М йаС 1, добавляют 30 мл культуральной жидкости (7,5 ед. А /мл и 7400 ед. акт/мл) и рН 6,5 и перемешивают при комнатной температуре на качалке в течение 0,5 ч. Переносят в колонку и со скоростью 7 мл/ч промывают 0,1 М Ваацетатным буфером рН 6,5, содержащим 0,5 М ИаС 1, до отсутствия поглощения при 280 нм. Десорбируют эндонуклеаэу тем же буфером при рН 5,0. Выход по активности 953, степень очистки 50 раэ, удельная активность 182000 ед. акт./мл белка.П р и м е р 2На колонку, содер" жащую 1 мл хелатного сорбента ИДК- тойоперла НУ(36 мкмолей/мл), уравновешенную 01 М Ка-ацетатным буфером рН 6,6 с 0,3 М КаС 1 со скоростью 15 мл/ч наносят 10 мл культуральной жидкости (5,4 ед. А/мл и 5600 ед. акт/мл) срН 6,6, отмывают 0,1 М На-ацетатным буФером рН 6,6, содержащим 0,3 М ЯаС 1 до отсутствия поглощения при 280 нм. Десорбируют эндонуклеаэу тем же буфером при рН 4,7. Выход по активности 807, удельная активность 200000 ед, акт./мг белка.П р и м е р 3. Аналогично примеру 2, но в качестве хелатиогосорбента использую ИЛК-силохром (19 мкмолей/мл), Выход по активности 653, удельная активность 1 ОООПО еп. акт./мл белка.1392902 Формула изобретения Сопоставительная таблица Способ Длитель"ность УдельнаяактивВыход,Хпроцес"са, ч ностьед.акт/мгбелка Предлага"емый 7-10 65-95 200000 Иэвестный 80-100 30-50 60000 Составитель Н. ХодаревТехред М.Ходанич Корректор А.Эимокосов Редактор О, Фнлипова Тирах 478 Подписное Заказ 1542 ВПИИЛИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж-Э 5, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ухгород, ул. Проектная, .4 П р н и е р 4. Аналогично примеру 2, но сорбцию фермента проводят при рН 6,0, в десорбцию при рН 5,5, Выход по активности 307 удельная ак тивность 150000 ед. акт/мг белка.П р и м е р 5. Аналогично примеру 2, но сорбцню фермента проводят при рН 8,0 в 0,005 М трис-НС 1 буфере, содерхащем 0,5 М НаС 1, а десорбцию 10 при рН 4,0,О, М Иа-ацетатным буфером, содерхащим 0,5 М КаС 1. Выход по активности 283, удельная активность 60000 ед. акт/мл белка.Таким образом, проведение процесса сорбции нуклеаэы на хелатном сорбенте в объеме позволяет значительно сократить время выделения фермента до 6-7 ч и с выходом 65-953 получить препарат, содерхащий не менее 753 20 нуклеаэы (определяют сканированием гелей после электрофореэа). Способ выделения и очистки бактериальной эндонуклеазы нэ культуральной хндкостн Яеггай 1 а вагсевсепв штамма ВКПМ Вс использованием методов хроматографии, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью сокращения длительности процесса, повывения выхода и чистоты целевого продукта, выделение и очистку проводят непосредственно из культуральной хидМости лигандообменной хроматографией на хелатных сорбентах, содерхащих имннодиуксусные группировки, за 1+ряхенные ионами Сц, при этом сорбцию ведут при рН 6,5 - 6,6, а десорбцию при рН 4,7 - 5,0 натрий-ацетатньм буфером, содерхащим 0,3 - 0,5 Н хлористый натрий.

Смотреть

Способ выделения и очистки бактериальной эндонуклеазы из культуральной жидкости sеrrатiа маrсеsсеus