Способ получения носителей для твердофазного синтеза олигонуклеотидов — SU 1439108 (original) (raw)

(19) (И 2 1/ 51) 4 С 07 Н 21/О ПИСАН ОБРЕТЕНИ Н АВТОРСКОМУ ЕЛЬ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии(56) Ковчег Н., Вцгпай Л., Мапцз,У.Мс.,ее а 1 Ро 1 ушег зцррогй о 1 хропцс 1 еоеЫеяупгЬев 1 в - ЖЧ. БупйЬевхз ой о 1 ддоЙеохупцс 1 еоСЫея оп соп 1 го 11 ей роге81 авз (СРС) ця 1 пи рЬоврЬайе апд а пеюрЬозЬ 1 ге г 1 еяСег арргоасЬ- ТеггаЬес 1 гоп, 1984, Ч. 40, В 1, р. 103-112.Мп 8 апг С., СапезЬ К. Н. ей а 1.Сошраг 1 зоп оГ сопгго 11 ей роге а 1 аззапд К 1 еяе 1 ацЬгро 1 Ы 1 шейЬу 1 асгу 1 ашЫеаз яцррогйз Хог яо 1 Ы-рЬаве вупйЬея 1 вой 23-гезЫце о 1 Цойеохуг 1 Ьопцс 1 еоедев 1 п ш 1111 агаш ашоцпСз, - В 1 осЬеш,1985, ч. 147, р. 63-74,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОСИТЕЛЕЙ ДЛЯТВЕРДОфАЗНОГО СИНТЕЗА ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ(57) Изобретение относится к химииполимеров и позволяет получать носители для твердофазного синтеза олигонуклеотидов, содержащие 0,3 О -0,450 ммоль иммобилизованного нуклеозида наг носителя. Носители получают последовательной обработкойкремнезема 5-6 Е-ным водным раствором Р-маннита, 1-2 Е-ным растворомэпоксидной смолы ДЭГ- в диоксане инуклеозидом,табл.Изобретение относится к химии полимерон, а именно к способу полученияносителей для твердофазного синтезаолигонуклеотидов и может быть использовано в биоорганической химии и био.технологии для синтеза олигонуклеотидов как в ручном, так и в автоматическом режиме.Целью изобретения является повышение количества иммобилизуемого нуклеозида.П р и м е р 1. К 1 г пористогостекла СРС(удельная поверхностьо17 м /г, диаметр пор 2200 А, размер 15частиц 120-20 мк) добавляют 30 млконцентрированной азотной кислоты,выдерживают 2-3 ч, отмывают водой донейтрального рН. Затем добавляют10 мл 10%-ного водного раствора Пманнита (ч.д.а.), дегазируют, перемешивают в течение 1 ч, дважды опынают на пористом стеклянном фильтре10 мл воды и трижды 10 мл диоксана.Далее добавляют 20 мл диоксана, 250,2 мл СН, 0 ВР 9 (ч), перемешивают5 мин, добавляют 0,2 мл эпоксиднойсмолы ДЭГ(динамическая вязкостьне более 15-30 сП, мол.масса 240260, содержание эпоксидной груптты 3024%) и интенсивно перемешивают нтечение 40 мин при комнатной температуре, затем отмывают диоксаномводой, пиридином, К О,1 г обработанного таким образом стекла добавляют(ПМТгС 1 Втт), 0,3 ммоль ТРБС 1, 0,9 ммольМе 1 ш и 0,2 мл абс. пиридина, осторожно перемешивают н течение 1 ч, После 40этого носитель промывают пирттцином,хлороформтм, ацетоном и сушат,Емкость по нуклеозиду (количествоиммобилизованного нуклеотида) на носителе определяют спектрофотометрически по диметокситритилкарбинолу(ЭМТгОН) после снятия с носителя диметокситритильной группы обработкойраствором хлорной кислоты и этиловомспирте (3:2 Ч/Ч) при,длине волны 50499 нм, коэффициент экстинции ЭМТгОН71,7ммоль смРасчет содержания нутФеозида наносителе проводят по Формуле 55 т/ ю 1000 Етп 1где С - содержание нуклеозида - содержание диметокситритильнойгруппы на носителе, ммоль/г;П - общая оптическая плотностьэлюата с И 1 ТгОН;Ч - объем элюата, мл;Е - коэффициент экстинции 0 МТгОНпри 499 нм;ш - навеска носителя, г;1 - 1 см - длина оптического пути кюветы, н которой измеряютоптическую плотность.Определение содержания нуклеозидана полученном чосителе, К 0,01 г носителя, содержащего И 1 ТгСтВтт-группы,добавляют 2 мл.раствора хлорной кислоты в этаноле, раствор приобретаеторанжевый цвет, выдерживают 1-2 мин,отфильтровьвают, операцию повторяют,Элюаты объединяют и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре:0 = 55,56 Ч = 4 мл, ш = 0,01, содержание нуклеозида С = 0,310 ммоль/г.Пример 2, К 0,1 г СРС 109обработанному В-маннитом и ДЭГ, ккак описано н примере 1, добавляют/0,1 ммоль 5 -о-диметокситритилтимидин-о-сукцината, 0,3 ммоль ТРБС 1,0,9 жюль Ме 1 ш, 0,2 мл абс, пиридина, осторожно перемешивают в течение1 ч. Затем промывают пиридином, хлороформом, ацетоном н сушат, Содержание нуклеозида определяют как нпримере 1. Э = 80,66, гп = 0,01 г,Ч = 4 мл, С = 0,450 ммоль/г.П р и м е р 3, К 1 г пористогостекла МПС 2000 (Буд15 20 мг/г 9с 1 = 2000 А, с 1 С = 100-300 мк),Поприбавляют 10 мл 5%-ного раствораО-маннита, дегазируют и перемешивают в течение 1 ч, Дальнейшую обработку проводят, как в примере 1. Содержание нуклеозида на носителе определяют как в примере 1, Э = 54,85,Ч = 4 мл, тп= 0,01 г, С- 0,306 ммоль/г,П р и м е р 4. 1 г пористогостекла МПС 2000 обрабатывают аналогично примеру 1, только вместо 10%ного раствора Э-маннита берут 16%-ныйраствор. Содержание нуклеозида определяют как н примере 1. Г/ = 75,46,Ч = 4 мл, ш = 0,01 г, С = 0,421 ммоль/г. П р и м е р 5, 1 г пористого стекла СРС 10 обрабатывают аналогично примеру 1, только вместо 0,2 мл ДЭГдобавляют 0,4 мл эпоксидной,нуклеовила еель/г Обработка Матрица Пример О"мвннит, Количество2 ДЭГмг/гносителя СРС 10 0,310 но ОИТгС 28 и0,450 по Жттт0,306 ло 1 к 12 С(Ъй 2200 17 0,2 М,С 20 МК 9 (иввестный) Ецве)А 1 пЪт 2000-3000 15-20 Пептид Поляцнметил,08 - 0 2акр ил амин Подписное 4Тираж 348 ВНИИПИ Заказ 6038/24 Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная,з 14смолы. Содержание нуклеозида на носителе составляет 0,352 ммоль/г.П р и м е р 6 (контрольный),1 г пористого стекла МПС 2000 обрабатывают аналогично примеру 1, тольковместо 10%-ного. раствора Р"маннитаберут 2%-ный раствор. Содержание нуклеозида, определенного аналогичнопримеру 1; 0,126 ммоль/г.П р и м е р 7 (контрольный). 1 гпористого стекла СРС 10 обрабатываютаналогично примеру 1, только вместо0,2 мл ДЭГберут 0,1 мл эпоксиднойсмолы, Содержание нуклеозида0,150 ммоль/г,П р и м е р 8. 1 г силохрома С(Б, = 15-25 мг/г, Йпор, =.1300 А, Й= 315-500 мк) обрабатывают азотной кислотой, отмывают водой до нейтрального рН как в примере 1, затем промывают диоксаном, добавляют 20 мл диоксана, 0,2 мл эфирата трехфтористого бора, перемешивают 5 мин, добавляют 0,4 мл ДЭГ, интенсивно перемешивают 40 мин при комнатной температуре, затем отмывают диоксаном, водой, пиридином. К обработанному таким образом кремнезему (0,1) присоединяют нуклеозид аналогично описанному в примере 1. Содержание нуклеозида 0,003 ммоль/г.1 391084На носителе, полученном в примере 2, синтезируют октадекадезоксирибонуклеотид Й (ААААТАСТССАТСАСССТ) фосфотриэфирным методом. Средний выход на стадию ло ПМТгОН 84%, а общий выход после хроматографического выделения 1,20% от теоретическогоНа носителе, полученном в примере 2, 10 синтезируют октадезоксирибонуклеотидЙ (СССССТАС) фссфитным методом, Средний выход на стадию по РМТгОН 90%в а общий выход после хроматографического выделения 20% от теоретического.15 Характеристики предлагаемых и известных носителей приведены в таблице. Формула изобретения20 Способ получения носителей длятвердофазного синтеза олигонуклеотидов, включающий обработку кремнезема полимером и нуклеозидом, о т л и - 25.ч а ю ш и й с я тем, что, с цельюповышения количества иммобилизуемого нуклеозида, кремнезем перед нанесением нуклеозида предварительно обрабатывают 5-16%-ным водным раствором 30 1)-маннита и 1-2%-ным раствором в диоксане эпоксидной смолы на основе полиола и эпихлоргидрина в присутствии трехфтористого бора.

Смотреть

Способ получения носителей для твердофазного синтеза олигонуклеотидов