Способ получения ферментных мембран — SU 1535892 (original) (raw)
СОЮЗ СОВЕТСКИХСО)1 ИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК О 1 19 8, 11/00 С 12 И ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ПО ИВЕБР- ттИ: МЛ И ДТКР. ГИ.при Г.1 нт ссср Ог) ИСМ" ) ИЕ ЙЗО И АО ГОРСКОМ СВИДЕТЕЛЬ(21) (22) 1 лб) 33633 ) 13 0 ч 88 ОИ д вностл. е качес ль иэобре целевого родук иэмер 5,01,;0, )ю 1, 1 нс гитут)1 и счет расширения конц)-нтраций Г Способ получе иапазон стратов 2(л торс1 1) 2 Г .)С 1;)С осителя ис э ют м рис гье 0,02 - 3 дерные фильтры приготовленн ки путем ее обллето е иэ лавс ения в (скоазов с по леи.ые дующи Способ е Оси гся к биотех способам получе ь ермен Г е. ; и е о г а 1 О,о хНТНЬХ 11;-0) мембра центра пазсне гда ка не в в е могут ан, кот,г лучеьэуют ядер.0)02-3)0 )пленки пу" тельных электитое) ний и нь стет полу. ригодные ле каетых кои субстр лесто 1,Г)1 Е Н- ОВ, с вяз ьва нии 1.1 лб ра НОй Сг .с,ф Е Р С. 1; ) Е С Г.3 Примерядерного фильт Проводят травлетолщиной 10 мкм)на эмеряемОВ Згя аключается в связывании ерме нерастворимым гленочным носите присутствии глутарового альдесьвороточного альбумина. В ка иона)ли инертных г гравлс Ием в раст позволяет получит ны,пригодные для из ций субе гратов фермкс)целтра цлей с ьзвест ые мембр до концентрации 1 путем обработки глутаровь дом в присутствий сыворот альбумина. При этом испол ный фильтр с пористостью полученый из лавсановой тем -.е обработки ионами и зов с последующим травлен воре щегочи, Способ позво чить ферментные мембраны, для из( ерения концентраци .ов ферментов Г)-100 мМ (в 2 мМ), 153589220 л,-ным раствором едкого натра при50 С. Пористость получаемых при этомядерных фильтров зависит от временитравления (табл,1). Она составляет0,02-31, Для приготовления ферментного слоя 1600 ед. глюкозооксидаэы растворяют в 0,6 мл 0,01 М фосфатногобуфера рН 6,8, добавляют 0,4 мл 4,54 ного сыворотоцного альбумина и0,04 мл 253-ного глутарового альдегида. Эту смесь тщательно перемешивают и выливают на ядерные Фильтрыразмерами 20 х 20 см. На поверхностьприготовленных двухслойных мембраннадевают ацетатцеллюлозную мембранутолщиной 10 мкм. Полученные трехслойные мембраны помещают в холодильникна 24 ч. Затем разрезают на кускидиаметром 2 мм и накладывают на Рэлектрод (с Р электродом контактирует ацетатцеллюлоэная мембрана) иопределяют ток электрода при рН7,2 и 19 С, задавая 0,6 В отн,Аа/АдС 1 электрода.Зависимость чувствительности электрода и диапазона линейного участкакалибровочных графиков от пористостилембраны приведена в табл, 1.Аналогично примеру 1 -отовя; тэехслойную мембрану с испольэса;",макропористой мсмбра ы по иэ;."гч,;,успособу (пористость 4 /),. и. а,илинейного участка градуировоц огограши,;а при использоь.нии э мембраны составляс:т 1,9 мМ., аувствительность - 21,6 нА/мМ,П р и м е р 2. Аналогицно примеру1 изготавливают Ферментную мембранудля определения этанола с использованием алкогольоксидазы. Для сравненияпараллельно используют макропористуюмембрану по прототипуВ табл. 2 приведены сравнительныепараметры полученных электродов.Иэ этих данных следуе , что линейность градуировочных графиков в случае использования ядерных фильтровнаблюдается до 30 мМ в случае электрода 2, до 15 мМ (3), до ;,5 мМ (4)и до 5 мМ (5), тогда как градуировочный график электрода, содержащегомембрану (1), изготовленную согласноизвестному способу, нелинеен уже приконцентрации 2,5 мМ.П р и м е р 3. Аналогично примеру 1 изготавливают ферментную мембрану для определения лактата. Для приготовления ферментного слоя 50 ед, 10 40 45 50 55 Наибольший диапазон линейности градуировочного графика наблюдается при использовании ядерного фильтра с пористостью 0,023, однако при этом чувствительность электрода уменьшается до 0,05 нА/мМ. Аналогичная взаимосвязь между диапазоном линейности и чувствительностью следует также из макрокинетического уравнения. Таким образом, оптимальными параметрами с практической точки зрения обладают мембраны, в которых используются ядерные фильтры с пористостью 0,05-33. Они обладают линейностью в практицески важном диапазоне концентрации глю 15 20 25лактатоксидазы растворяют ; каплесмеси сывороточного альбумина и глутарового альдегида в пропорциях какв примере 1 и выливают на ядерныйфильтр, определяют ток электродапри рН 7,2.Линейная зависимость градуировочного графика при испопьзовании ядерного фильтра наблюдается до концентрации лактата 10 мМ в том время какв случае использования макропористой мембраны она сохраняется топьнодо концентрации 1,5 мМ, Диапазон измеряемых концентраций расш, ряется в6 раз.П р и м е р 4. Сравнительное определение глюкозы в кре.и с использованием Фериентнс мембраны, изготовленной пэ предложенн,му и известному способам,Готовят фермеиа мембрану аналогично примерунаносят ее наэлектрод, измеряют ток пр нанесениина электрод кап-;и неразбаленной крови, Параллельно изготавливают ферментную мембрану по известному способу, измеряю к электрод- в20-кратно раз ;енном о, зцс исс."е,пуе;лой кро ,при помощи анализа, .; ЭКСАН-Г),установлены;е концентрации глюкозы приведены в табл. 3.Как видно из табл. 3, найденныеконцентрации практицески совпадают.Данные, приведенные в табл. 1 показывают, цто при использовании ядерных фильтров, пористость которых0,02-34, обеспечивается достижение цели, так как диапазон линейноеи градуировочных графиков расширяется в 2-50 раэ, т,е, концентрация определяемой глюкозы в растворе может составлять 4-100 мМ, вместо 1,9 мМ.535892 ь 2-50 раз (от 4 до 100 мМ вместо 1,9 мМ). Бремя тления,0,5 8 1 О 12 13 15 20 25 300)02 0,03 0,05 01 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 ПористоД иапазо но ногочМ 50 35 25 увс; еи тельос ть, нй/м 1 Табли к электрода, нА, при концентции этанола, мМ Электро 2 2,5 5 7,5 10 15 20 30 40 25 0,5 82 83 12 12 82 82 5,2 8 30 30 ,6 65 7062 72 80 81 8 1,8 2,712 17,5 2 34 48 5 49 55 6 32 64 780,35 0,7 0,92,5 4,7 66,8 13 179,5 19 24 О,О 0,181,23,4 оды исследоваЭтанолчув ны при рН брану (1) ры (2-5);15 мин (3 твительные эле П р им а ни ропористую мемые ядерные филь10 мин (2), 30 мин (5) .Таблица жат ма опорис авлени соде ли миквремя мин ерментная ембрана по способу Концентрация гл мМ 3 5,1 4,5 8,3 3,0 41 4,9 4,8 8,4 3,1 6,2 12,06,0 12,4 редло;(," ном арестному ристостью 0,051. Используют ядерный фильт П р и м е ц 5 1 козы и достатоцной чувствительностью,Механическая прочность ядерных фильтров до травления составляет 12,6-13,4 кг/мм и уменьшается до 9,3 кг/мм при травлении в течение 30 мин при 50 С и в 201-ном растворе щелочи, Таким образом, прочность предложенной мембраны с низкой пористостью больше, цем макропористой мембраны по известному, прочность которой меняется в пределах 7,5- 9,1 кг/мм при изменении пористостигот 4,7 до 11,й .Таким образом, грименение предложенного способа позволяет улучшить качество целевого продукта за счет расширения диапазона измеряемых концентраци субст атов Ферментов в Формула изобретения5 Способ получения ферментных мембран, включающий связывание ферментовс лавсановой мембраной путем обработки глутаровым альдегидом в присутствии сывороточного альбумина, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюулучшения качества целевого продуктаза счет расширения диапазона измеряемых. концентраций субстратов Ферментов,в качестве лавсацовой мембраны используют ядерные Фильтры с пористостью 0,02-3,0 г, полученные из лавсановой пленки,Табли ца 1 1,0 1,65 2,5 5 12,5 20