Рекомбинантная плазмидная днк pbg м3, определяющая синтез эндонуклеазы рестрикции с bi — SU 1573026 (original) (raw)

Ъ 1 а-ген, ответственный за синтез-лактамазы, обеспечивающий устойчивость клеток с плазмидой рВС МЗ к ампициллину;Ьвй К, С 2 гВ 1-ген, кодирующий эндонуклеазу рестрикции сГгВЕ, обеспечивающий ограничение фаге р 80 афпг,Ьвй М. сйгВ 1-ген, кодйрующий метила;зу сГгВ 1, обеспечивающий модификацию;нуклеотидной последовательности ЦЦА/Т А/Т ГГ и защиту ДНК от расщепления рестриктазой сйгВ 1, ого - репликон плазмиды рМВ 1,Конструирование рекомбинантнойплазмидной ЛНК рВС МЗ.Экстрахромосомальную ДНК, выделен,ную из СхггоЬасгег ггеыпйЫ 4111продуцента рестриктазы сКгВ 1, и ДНК;плазмиды рВК 322 гидролизуют рестриктазой Рвг 1 при 37 С в течение 1 ч вбуфере А 10 мМ трис НС 1, рН 7,5, 50 мМНаС 1 10 мМ МцС 1, 1 мЕ дитиотреитол,; фермент инактивируют экстракцией ДНКводонасыщенным фенолом, после чего2 мкг РвГ 1-гидролНзата ДЛК из СГгоЬасгег Егецпйг 1 смешивают с 0,2 мкгРвг 1-гидролизата рВК 322, добавляютАТФ и проводят реакцию в присутствиио0 1 ед. ДНК-лигазы фага 4 при 10 СВ3016 ч. Лигазу инактивируют прогреванием при 65 С 10 мин и инкубационнуюсмесь используют для трансформациикомпетентных клеток Е. со 11 НВ 101 поописанной методике,Среди трансформантов, выросших на 35селективной агаризованной среде с тетрациклином (20-мкг/мл), отбирают чувствительные к ампициллину (50 мкг/мл),которые затем проверяют на наличиесистемы рестрикции-модификации сггВ 1. 40Проведенный анализ позволяет заключить, что все они являются контрансформантами делеционных вариантов плазмиды рВК 322 и плазмиды Ь 2 Е 8, кодирующей систему рестрикции"модификации 4сйгВ 1,На следующем этапе в качестве вектора используют ДНК плазмиды рМЖ 1560,содержащую уникальный сайт М 1 ц 1 вструктурной части гена 1 ас 1 , ДНК р 2 Е 850и ДНК рМЛК 1560. гидролизуют рестриктазой М 1 п 1 в условиях, рекомендованныхфирмой Меч Епя 1 апй Вдо 1 аЬв, 4 мкгМ 1 и 1-фрагмента ДНК вектора рМЖ 1560дефосфорилируют щелочной фосфатазойиз кишечника теленка в условиях, рекомендованных фирмой ВоеЬг 1 пяег МапсЬеп, экстрагируют три раза Фенолом,один раз хлороформом и дважды пересаждают спиртом, 2 мкг дефосфорилиованного М 1 п 1 Фрагмента рМЗК 1560смешивают с 4 мкг М 1 ц 1 фрагментовр 2 Е 8 и проводят реакцию в присутствииДНК-лигазы фага Т 4 в описанных условиях, Полученной смесью трансформируют компетентные клетки штамма Е. со 11К 802, трансформанты подращивают 2 чв бульоне 1,В инфицируют фагом р 801 г9с множественностью заражения 10 ивысевают на агаризованную среду, содержащую 50 мкг/мл ампициллина, Изклонов, резистентных к ампициллину,выделяют плазмидную ДНК рВС МЗ известными способами,Проведен анализ наличия рестриктазы сГгВ 1 в клетках Е, со 1 ь.Для этого клетки Е. со 11 К 802//рВС МЗ выращивают в 10 мМ 1,В бульона до поздней логарифмической стадиироста, собирают центрифугированием,ресуспендируют в 5 мл буфера В, (10 мМтрис НС 1, рН 7,5, 50 мМ НаС 1, 10 мМЭДТА 10 мМ 2-меркгптоэтанола), раз-.рушают ультразвуком, центрифугируютпри 6000 об/мин 1 ч для освобожденияот клеточных обломков,Для определения активности готовятразведения экстракта в буфере С (10 мМтрис НС 1, рН 7,5, 50 мМ ИаС 1, 10 мМЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанол,100 мкг/мл 1: 10, 1: 100, 1: 200, 1:400,1 ф 1000. В инкубационную смесь (9 мкл),содержащую 10 мМ трис-НС 1, рН 7,5,10 мМ МяС 1 г, 7 мМ ДТТ, 50 мМ ИаС 1,1 мкг ДНК фага 3 с 1857 добавляют1 мкл соответствующих разведений эксторакта и инкубируют при 37 С в течение1 ч, Результаты гидролиза проверяютс помощью электрофореза.1 мл полученного экстракта содержит до 2 х 10 единиц активности.Таким образом, получена рекомбинантная плазмида рВС МЗ, содержащая гены системы рестрикции - модификациис 2 гВ 1. Данная плазмида обеспечиваетсравнительно высокий уровень синтезаэндонуклеазы рестрикции сйгВ 1. Наличие детерминанты резистентности к ампициллину позволяет переносить плазмиду рВС МЗ путем трансформации в разные штаммы Е. со 1 ь, оптимизироватькультивирование целевых штаммов и выращивать штамм продуцент в селективныхусловиях.1Формула изобретенияРекомбинантная плазмидная ДНК рВСМЗ, определяющая синтез эндонуклеазыСоставитель Е, КузнецоваРедактор Н. Бобкова Техред М.Ходанич Корректор С.Шекмар Заказ 1621 Тираж 500 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 10 5 5730рестрикции сйгВ 1 размером 7,1 т.п,н.,содержащая: М 1 и 1 - фрагмент ДНК вектора рМЖ 1560 размером 3,9 т.п.н.,М 1 ц 1 - фрагмент ДНК рЕЕ 8 размером53,2 т,п.н. с геном системы рестрикциимодификации сйгВ 1,сайты рестрикции:три участка узнавания рестриктазойЕсоКЧ, расположенных на расстоянии5,0 т.п,н., 1,6 т.п.н; 0,5 т,п,н,три участка узнавания рестриктазойЕсЬК 1, расположенных на расстоянии3,8 т,п.н, 2,4 т,п,н, 0,9 т.п.н;два участка узнавания рестриктазой БКрп 1, расположенных на расстоянии 4,4 т,п,н, 2,7 т,п,н;уникальные участки узнавания для рестриктаз Ра 11, Нпй 111, Нра 1 и ХЬо 1;генетические маркеры:Ъ 1 а-ген, ответственный за синтез р- лактамазы, обеспечивающий устойчивость клеток к ампициллину; Ьзй В.сйгВ 1-ген, кодирующий эндонуклеазу рестрикции сйгВ 1, обеспечивающий ограничение фага в 80 чг; Ьзд М сйгВ 1-ген, кодирующий метилазу сйгВ 1, обеспечивающий модификацию нуклеотидной последовательности Щ А/Т А/Т ГГ и защиту ДНК от расщепления рестриктазой.

Смотреть

Рекомбинантная плазмидная днк pbg м3, определяющая синтез эндонуклеазы рестрикции с bi