Штамм бактерий еsснеriснiа coli для получения рибавирина — SU 1661209 (original) (raw)
СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 9) .ъЖ КОМИТЕТИ ОТКРЫТИЯ ГОСУДАРСТВЕННПО ИЗОБРЕТЕНИПРИ ГКНТ СССР 1"Л:2 й 3 ВЯ ОПИСАНИ К АВТОРСКОМУ С БРЕТЕН ЕЛЬСТВ(71) Институт микробиологии АН БССР(56) ЗЫгае НЗосогеИ К., ОсЫ 9 уап 1 а МКиЬоса КЕпугпэтс ргос 0 сбоп оЮ г 1 Ьач 1 г 1 п1 гопз риг 1 пе посеозЫез Ьу ВгечЬастегйаасетуИсцгп АТСС 954/ - Адгс. Во 1. СЬеа. -1988, ч. 52, Ив 7,р. 1777-1783,(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ЕЯСНЕ 111 СНАСОДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РИБАВИРИНА к микробиолов частности к ных соединеИэобретегической пропроизводствний,ние относитсямышлен ности,у противовирусЦелью изобретения является нопериментально полученный штаммрии ЕзсЬег 1 сЬ 1 а со 11 БМТ-ЗД/1 А сповышенной активностью клеток в реакциисинтеза рибавирина, в связи с чем его используют для получения этого противовирусного нуклеозида,мм го т музеино и 3110 путе риантов пр нии на пл Адамса с т нарабиноз ника тим содержа ще мг/мл) в кэ Е.соИ БМТ-ЗД/1 А получен из иминэависимого штамма Е.соИ отбора наиболее активных вапоследовательном выращиватной агаризованной среде мином (1 мкг/мл), затем с тимиом (5 мкг/мл) в качестве источна и наконец на среде, тимин (1 мкг/мл) и гуанозин (1 естве источника углерода,1661209 12 й 1/20, С 12 Р 1/04(57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству противовирусных соединений, и касается нового штамма бактерий, используемого для получения рибэвирина, Целью изобретения является новый,экспериментально полученный, штамм бактерии ЕзсЬег 1 сЫа соИ ВКПМ В - 4834 с повышенной активностью клеток в реакции синтеза рибавирина, Рибавиринсинтеэирующую активность измеряют путем прямого определения количества рибавирина, образующегося при инкубации сырой биомассы клеток с изанозином и ТК. Штамм Е.соИ БМТ-ЗД/1 А депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов под коллекционным номером ВКПМ В - 4834 и характеризуется следующими признаками.К льт ально-мо ол гич ки иу ур рф о ес е пр знаки.Под микроскопом клетки имеют вид прямых палочек с закругленными концами (1,1-1,5)х(2-6) мкм. Встречаются отдельно или парами. Спор и капсул не образуют. Клетки обладают подвижностью, По типу движения - перитрихи. Грамотрицательные.В бульоне Хоттингера к 24 ч (37 С) рост выражен в виде легкого помутнения, На дне пробирок образуется комковатый осадок. который полностью взмучивается при встряхивании (Я-форма),На МПА и агаризованной среде Адамса (37 С, 3 сут) колонии гладкие. слабо выпуклые, легко сливающиеся. Консистенция вяз 1661209кая, Цвет колоний сероватый. Поверхностьблестящая, рельеф однородный. Края колоний слегка волнистые.На агаризованной дифференциальнойсреде Эндо штамм растет в виде полупрозрачных колоний без изменения цвета среды,Диапазон температуры роста 7 - 40 С.Оптимальная температура 36 - 37 С.Диапазон рН роста 5,5-8,5, Оптимумроста наблюдается при рН среды 7-7,5.Физиолого-биохимические признаки.Факультативный анаэроб. В процессероста сбраживает до кислоты с незначительным выделением газа глюкозу, арабинозу, трегалозу, мальтозу, маннит,глицерин, Не усваивает сахарозу, лактозу,оэфинозу сорбит, дульцит.В качестве единственного источника углерода может использовать ацетат, но нецитрат и инозит,Желатину не разжижает,Крахмал не гидролизует.Молоко не свертывает,Гидролизует РНК,Гемолитическими свойствами не обла,:,эет, Не токсичен и не патогенен для теплокровных животных,Усваивает аммонийный и нитратныйазот, Наиболее активный рост биомассыобеспечивают органические источники азота (пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты, ферментолизат БВ К),Продуцирует индол, каталазу.Не образует уреазу и оксидазу,Содержание Г+Ц в составе ДНК50,30,5 мол.,ь (определено оптическим методом).Штамм нетоксичен и непатогенен длятеплокровных животных,Культура сохраняет жизнеспособностьне менее года при хранении в холодильнике(4 С) на полноценной агаризованной среде(МПА, среза Хоттингера) под слоем вазелинового масла, а также в лиофильно- высушенном состоянии.Штамм Е.соИ БМТ-ЗД/1 А способен синтезировать рибавирин с эффективностью1,05 ммоль/ч/г клеток (в расчете на сухуюмассу).Рибавиринсинтезирующую активностьизмеряют путем прямого определения количества рибавирина, образующегося приинкубэции сырой биомассы клеток с гуанозином и ТК. С этой целью реакционнуюсмесь (1 мл), содержащую 10 мМ К-фосфатный буфер(рН 7), 15 кг клеток, гуанозин и ТКв концентрациях 0,3 М, инкубируют при 60С в течение 8 ч. После инкубации реакционную смесь центрифугируют (80009, 10 мин)на/ч/г.35 П р и м е р 2. Клетки Е.соИ БМТ-ЗД/1 А,выросшие в двух 250 мл колбах, согласно примеру 1, используют в качестве посевного материала и засевают ими лабораторный ферментер АКемкостью 3 л, содержащий 40 2 л питательной среды следующего состава,г/л: 6 йа 2 Н РО 4; 3 КН 2 РО 4; 0.5 йаС 1; 1 й Н 4 С 1;0,125 М 9 304 х 7 Н 20; 40 ферментализат Б В К.Начальное значение рН 7,5, Ферментацию ведут 12 ч при 37 С и аэрацией 0,8 л/мин 45 на 1 л среды.По окончании культивирования клеткисобирают центрифугированием (80009, 10 мин), получая 8 г клеток (в расчете на сухую массу) с рибавиринсинтезиру ющей активностью 1,05 ммоль/ч/г сухоймассы.10 мл смеси, содержащей 0,3 М ТК, 0,3М гуанозина, 10 мМ К-фосфатный буфер (рН 7), инкубируют с перемешиванием 30 ч при 55 60 С. После осаждения клеток центрифугированием (80009, 10 мин) их дважды промывают 10 мл воды. Супернатанты объединяют и наносят на колонку(2,5 х 4 см) с ионообменной смолой Оовех 50 а х 8 в Н -форме. Колонку промывают водой, Фракции,101525 30 и надосадочную жидкость хроматографиру-,ют на тонкослойной пластинке "ЯМо 1ОЧ 254" (КачаИег, ЧССР) в системе растворителей изопропано-хлороформ - 25 оь водный аммиак (10:5:2). Целевой продукт обнаружен в Уф-свете, идентифицируя сравнением с положением образца-свидетеля, иэлюируют водой, После внесения в элюат фосфатного буфера (рН 7) его оптическуюплотность замеряют на спектрофотометре, Концентрацию рибавирина рассчитывают, используя коэффициент молярной экстинции при длине волны 207 нм, равный 11600.В таблице дана сравнительная оценка эффективности наиболее активных иэ 80 проверенных штэммов микроорганизмов,П р и м е р 1, Культуру штамма Е,соИ БМТ-ЗД/1 А вносят петлей с косяка в колбы емкостью 250 мл, содержащие 50 мл МАБ с0,5 о-ным дрожжевым экстрактом и 0,5КаС 1, культивируют на биологической качалке (180 об/мин, в течение 16 ч при 37 С, Приготовленным посевным материалом вколичестве 5; засевают лабораторный ферментер АКемкостью 3 л, содержащий 2 л питательной среды того же состава. Ферментацию ведут 12 ч при 37 С с аэрацией 0,8 л/мин нэ 1 л среды.По окончании культивирования клетки собирают центрифугированием (80009, 10 мин), получая 3,5 г клеток (врасчете на сухую массу) с рибавиринсинтезирующей активностью 1 ммоль рибавири1661209 Примечание. Относительная эффективность других штаммов не превышает 10 6. Составитель В, АгафоноваМ; Стрельникова Техред М.Моргентал, Корректор Э. Лончакова Реда каз 2097 Тираж Г ВНИИПИ Государственного комитета по изоб 113035, Москва, Ж, РауПодписноеениям и открытиям при ГКНТ СССкая наб., 4/5 оизводственно-издательский комбинат. "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 содержащие рибавирин (200 мл), объединяют и наносят на колонку (1,15 х 4 см) с ионообменной смолой Ооаех 1 х 8 в ОН-форме. Промывая колонку водой, получают раствор рибавирина (340 мл), который упаривают до объема 6 мл, прибавляют 30 мл этанола и упаривают досуха. Остаток. растворяют в 5 мл этанола при нагревании с обратным холодильником на водяной бане. После кристаллизации на холоде рибавирин собирают на стеклянном фильтре и сушат до постоянной массы при 60 С в течение 18 ч в суховоздушном шкафу. Получено 0,491 г хроматографически чистого целевого продукта, что соответствует выходу 67 от теоретически возможного,При хроматографировании на тонкослойных пластинках "5 о 1 о 1-ОЧАМ" в системах растворителей изопропанол-хлороформ - 25 аммиак(10:5:2) и н-бутанол - 25 аммиак (7:2) подвижность целевого продукта совпадает с й контрольного препарата рибавирина.Т,пл. целевого продукта 163 в 1 С.Элементный анализ для СвН 1205 И 4, М =5 =244.Найдено, : С 39.85; Н 4,99; й 22,70.Вычислено, ; С 39,34; Н 4,95; й 22,94.1 н-ЯМР(ДМСО - бв)7 м,д. от ТМС: 8,87 с= 3,6 Гц, А, 5 = 12 Гц); 3,52 дд (1 Н, Н - 5",Лб, 4=4,8 Гц),Формула изобретения20 Штамм бактерий ЕзспегсЬа соНВКПМ-Вдля получения рибавирина.