Конъюгат аденилил(2 -5 ) аденилил-(2 -5 ) аденозина с бычьим сывороточным альбумином, используемый для получения антител, специфичных к 2, 5 олигоаденилатам (original) (raw)
СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1735307 С 07 Н 21/00, СО 7 К 13 61 К 39 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Институт биоорганической химии АНБССР(56) Кегг 1. М., Вгони В. Е., рррА 21 р 51А 2 р 5"А, ап 1 иЬЬсог о 5. ргосеп зупйезззупйезеб асЬ еп ензугпе 1 гасс 1 оп 1 гов1 пСег 1 егоССгеаСеб сеПз //Ргос, йаС 1. Асаб, Яс 1.ОЯА, 1970, ч. 75, М. 1, р. 256 - 260,К 1 веЫ А., ЯЬеге Н., Вече М, Ведцас 1 опо 1 1 увр 11 осусе в 1 содепез 1 з Ьу (12-5 ) б 1 до -1 зоабепу 1 асе //йасцге (1 опбоп), 1979, Ч, 282, .М 5741, р. 849 - 851.Кп 1911 с М. Ягезсйпег О, НЯ 11 чегвап В.НКегг 1, М, Вабо 1 пвцпе апб Ваб 1 оЬпб 1 пдАззауз аког А 2 р 5 А 2 р 5 А,рррА 2 р 5 А 2 р 5 А, пб Веасеб01 допцсеосбез //Мейобз 1 п Епцуво,1981, Ч. 79, р. 216 - 227.СаИа Н., 1 ацгепсе 11 е Вогдпе, ОеКаоце С., Воцх О., Магс 1,. Мопосопаапс 1 Ьоб 1 ез со 2 - 5 А о 1 цопесеос 1 без;йег 1 цзе1 п габ 1 о 1 ввцпоаззау апб Веасеб Ргос, Меб,Ргос. 1 пс, Яувр. Ч 1 еппа 21-25,1 цпе. 1985,Чеппа, 1982, р. 33-44.Сагсег М. С., Меуег 11 оЛ М. Е, 1 пзсаЬ 11 суо 1 Яцсспу ЕЬсегз 11 пкадез 1 п 02 -Мопоз цсс 1 пу Сус 1 с АМ Р - РгосепСоп 1 пдасез ас йецсга рН //,1. ввцпо 1.Мейобз. 1985, Ч. 81, М 2, р, 245-247.КчазуцЕ Е. 1., Кц 1 аК Т. 1., 1 а 1 сзеча О. Ч.,М 1 Иаорц 1 о 1. А., СЬагцЬа 1 а В., РЛебегегчЧ.Яупйез 1 з оХ воббеб 2 "51-абепу 1 асе йсг в ег ччс 1 а 2,3 -б 1-0-(2-сагЬохуейу 1)есу 11 бепе сегвпа 1 дгоцр //Тесга 11 ебгоп .есс,1984, Ч. 25, В 34, р. 3683-3686.Чард Т. Радиоиммунологические методы. М,: Мир, 1981, с. 248.(57) Изобретение относится к биохимии,конкретно к конъюгату аденилил(2 -5 )аде 1 1нилил (2 -5 ) аденозина с бычьим сыворо 1 1точным альбумином. Цель изобретения -повышение стабильности, Конъюгат получают взаимодействием аденилил (2 -5 )аденилил (21-5")-2", 3 -0-(2-карбоксиэтил/этилиденаденозина с бычьим сывороточным альбумином в присутствииМ-этил-И -диэтиламинопропилкарбодиими - Зда в среде водной уксусной кислоты или натрийацетатного буфера, Полученный конъюгат стабилен в водных растворах и может бытьиспользован ля получения антител, специфичных к 2,5 -олигоаденилатам,;оо ооо о "боо о1,о оону-оЬСИо оо Еоо оиноОальбумон,который может быть использован для получения антител, специфичных к 2,5-олиго 1 1аденилатам.2,5-0 лигоаденилаты - природные низкомолекулярные биорегуляторы, которыеявляются медиаторами противовирусногодействия интерферона (1). Эти соединенияприсутствуют в различных органах и тканяхи обладают широким спектром биологической активности (2), Концентрация 2,5-оли 1 1гоаденилатов в клетках зависит отгормонального статуса организма и уровняциклических нуклеотидов. Это свидетельст-.1вует о воэможности использования 2,5 олигоаденилатов в качестве лекарственныхпрепаратов, а также для создания на ихоснове средств микроанализа для диагностики различных заболеваний (вирусные,аллергические, аутоиммунные и т.д.).Широкое распространение для определения природных соединений в биологических объектах получили методы,основанные на использовании антител, специфичных к этим соединениям. 2,5-0 лиго 1 1аденилаты сами по себе не обладаютиммуногенностью, поэтому для полученияиммунного ответа у животных они могутбыть использованы для иммунизации в видеконъюгатов с белками, Так как в общем пуле2,5-олигоаденилатов в клетке основная доля приходится на тример, то естественно,что конъюгаты должны быть получены на егооснове,Известен коньюгат аденилил(2-5)аденилил(2-5)аденозина с БСА формулы:1но-,НО 0-Р-ОНО О-Р-ОО О(ф5 10 15 20 в котором связь тримера с белком осуществляется путем периодатного окисления, 2,3-цис-диольного фрагмента 2-терми 1 нального аденозина с последующими конденсацией образующегося диальдегида с аминогруппами белка и восстановлением Шиффовых оснований (3), Такой способ получения в данном случае приводит практически к разрушению одного звена в молекуле антигена, что не может не сказаться на специфичности вырабатываемых животным антител.Более близким по сути к предлагаемому является конъюгат формулы;нооии НО О - Р-О О О Д О О О О Ени-о-си 1-си-с-о о-о-си-си-о-ии.аПолученный путем конденсации 0-сукцинильного производного аденилил-(2 -5)аде 1н азин а с Б СА (4). Существен н ы м недостатком такого конъюгата является наличие в молекуле лабильной сложноэфирной связи между молекулой димера и 30 остатком янтарной кислоты, Как было показано рля конъюгатов 2-0-сукцината адено 1зин,5-циклофосфата с белком, гидролиз1сложноэфирной связи и разрушение конъюгата происходит в водных растворах даже 35 при - 20 С(5).Целью изобретения является новыйконъюгат аденилил(2 -5)аденил ил(2 -5 р 2,31 1 с0-(2-карбоксиэтил)этилиденаденозина и БСА, более стабильный в сравнении с опи санными в литературе.Поставленная цель достигаетсяконъюгатом 1, который получают взаимодействием. аденилил(2 - 5)аденилил (2 -1 1 15) - 21,31-0-(2-карбоксиэтил)этилиденаденозина 45 (6) с БСА в присутствии М-атил-й-диэтиламинопропилкарбодиимида в среде уксусной кислоты или натрийацетатного буфера с последующим выделением и очисткой конъюгата известными способами, 50 Сущность изобретения иллюстрируетсяследующими примерами конкретного выполнения.П р и м е р 1.К раствору 10 мг БСА в 1 мл воды 55 добавляют 10 мг(0,007 ммоль)аденилил(215 ) аденилил ( 2"-.5 ) -2,3 -0-(2- карбоксиэтил) этилиденаденозина три (триэтиламмониевой) соли и 7 мг (0,036 ммоль) й-атил-М-диэтиламинопропилкарбодиимида гидрохло1735307 35 РНО О-Р - 0 45 е 50 рида, К полученному раствору добавляют по каплям 1 М раствор уксусной кислоты до рН 4,5 и выдерживают смесь в течение 20 ч при комнатной температуре. Раствор диализуют при 0 - 50 С против воды (Зх 500 мл) и хроматографируют на колонке с сефадексом 6-10 (200 смз). Продукт элюируют водой, Фракции, содержащие конъюгат, собирают и лиофилизуют. Получают 10 мг конъюгата, УФ-спектр в воде: Ямале 260 нм.Степень посадки антигена на белок в полученном конъюгате, определенная спектрофотометрически, составляет 5 моль тримера на 1 моль белка.Пример 2.К раствору 30 мг БСА в 3 мл 0,1 М натрийацетатного буфера с рН 4,7 робавляют 44 мг (0,033 ммоль) аденилил(21-5)аденилил(21-5)- 2 -3 -0-(2-карбоксиэтил)этилиденаденозина 1 1три(триэтиламмониевой сопи) и ЗО мг (0,11 м моль) ч-этил-М -диэтил аминопропилкар 1бодиимида гидрохлорида. Реакционную смесь выдерживают в течение 20 ч при комнатной температуре, диализуют при 0 - 50 С против 0,01 М натрий-фосфатного буфера с рН 7,35, содержащего 0,15 М йаС (4 х 500 мл) и хроматографируют на колонке с сефадексом 6 - 10 (300 см ). Продукт элюируют водой. Фракции, содержащие конъюгат, собирают и лиофилизуют, Получают 32 мг конъюгата, УФ-спектр в Н 20: Айзакс 260 нм. Степень посадки антигена на белок в полученном конъюгате, определенная спектрофотометрически, составляет 8 моль тримера на 1 моль белка.Конъюгат получают с высоким выходом (практически количественный) и хорошей степенью посадки антигена (5 - 8 моль тримерана 1 моль белка), что обусловлено стабильностью соединения как в процессе синтеза так и в процессе выделения, протекающих в водных растворах, Синтезированный конъюгат используют для получения антител, специфичных к 2,5-олигоаденила 1 1там, что подтверждается следующим примером,Пример 3.Пять кроликов (случайной породы, массой 2,3 - 2,5 кг) иммунизируют введением 0,5 мл эмульсии 0,25 мг конъюгата 1 в полном адъюванте Фрейнда подкожно в 4-5 точек на спине 7 раз с интервалом в 14 дн. Спустя 1,5 мес. после последней инъекции проводят 5 поддерживающих инъекций с интервалом в 14 дн. и через 10 дн. проводят забор крови. Антисыворотку выделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15мин, разбавляют 1:100 0,05 М ацетат-цитратным буфером рН 6,2-6,3 и хранят малыми аликвотами при -20 С,5 Высокоспецифичная антисыворотка к аденилил (2-5)аденилил(2-5)аденозину была1 1 1 1получена от двух животных через 3 мес,Характеристика антисыворотки.Путем последовательных разведений10 установлено, что 50%-ное связывание радиоактивно меченного лиганда достигаетсяпри разведении 1:6000, Константа ассоциации, определенная путем построения графика Скэтчарда(7), составляет 1;18 х 10 М ";15 Кроссреактивность антисыворотки к аденозину, аденозин-монофосфату, аденозин 15-трифосату 0,01% иаденилил(3-5)аденилил(3-5)аденозину составляет 0,020 ,20 Конъюгат, не содержащий в своейструктуре лабильных сложноэфирных связей, получают и выделяют с количественнымвыходом. Достигаемая степень посадки гаптена на белок обеспечивает необходимую25 иммуногенность для получения антител,специфичных к 2,5-олигоаденилатам. Кол 1 1нъюгат стабилен в водных растворах и может быть использован для иммунизации бездополнительной очистки после длительного30 хранения,Формула изобретенияКо нъ ю гат аде н ил ил(2 -5 )аденилил 1(2-5)аденозина с бычьим сывороточным1 1альбумином формулы; Ж Лаегде АбЕ =/ -Р - О1О О" используемый для получения антител, специфичных к 2,5 олигоаденилатам.