Способ определения антиокислительной активности карнозина — SU 1807353 (original) (raw)
СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУВЛИК 3 ьц 3 Гф 1БРЕТЕНИ ВИДЕТЕ 13етско-эападн нстанта .ИДудина и огерм иол,мед. 1989,тому мы счита ющего действ на в реакции наиболее г л тельную актив вии можно су по уменьшени рид-аниона по Способ о .разом,Карнозин ной воде до При это обье мый для иссл означает, что р ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССР(71) Совместное соское предприятие "К(54) СПОСОБ ОПРЕЛ ИТЕЛ Ь НОЙ АКТИ(57) Использованиемия, Сущность изоб ДЕЛЕНИЯ АНТИОКИС ВНОСТИ КАРНОЗИНА ; медицинская биохи ретения: к 1 мл 1 мМ Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской технологии и фармакологии, а именно к способам биологического тестирования различных лечебных препаратов.Цель изобретения - увеличение точности способа, уменьшение расхода изучаемого вещества, ускорение и упрощение способа,Цель достигают тем, что изучается расход гипохлорида натрия при взаимодействии с различными сериями карнозина.Согласно современным взглядам на патогенез ряда заболеваний, для которых характерно воспаление и деструкция собственных тканей в очаге поражения, в качестве основнога поражающего агента может выступать гипохлорид натрия. Поэтому антивоспалительное, ранозаживляющее действие,и другие терапевтические эффекты карноэина (как и тауфона-таурина) могут в значительной степени быть обусловлены именна способностью нейтрализовать токсическое действие гипохларид-аниона, Паэ 807353 А 1 3)ю 8 01 К 21/76, А 61 К 37/О раствора карнозина добавляют 1 мл 5 мМ раствора гипохларида натрия и спектрафотометрируют при 292 нм. Антиакислительную активность дипептида карнозин определяют па параметру А = (Ао - А+)/Ао, где Ао - оптическая плотность 2,5 мМ раствора гипохлорида натрия при 292 нм, А+ - оптическая плотность 1 мМ раствора карно- зина, Изобретение позволяет упростить и ускорить способ определение антиокислительной активности карнозина,ем, что изучение нейтрализуия различных серий каанозис гипохлорид-анионом может но отражать его антиокислиность. О таком взаимодейстдить спектрофотаметрически а ю характерного для гипохло- (р глощенйя при 292 нм С) уществляется следующим обрастворяют в дистиллираванонечной концентрации 1 мМ. м раствора карнозина, требуеедования, составляет 1 мл; это для тестирования каждой сеии требуется всего около 0,2 мг вещества. Об антиокислительной активности карнозиа судят по параметру А - (Ао - А+)/А где о - оптическая платность 2,5 мМ плотность ,5 мМ раствора гипохлорида натрия при 92 нм; А+ - оптическая плотность 1 мМ аствора карнозина, к 1 мл которого добаили 1 мл 5 мМ раствора гипохлорида натрия, Чем выше параметр А, тем выше анти. окислительная активность карнозина.П р и м е р 1. Для исследования взяткарнозин фирмы "Зегча" (США), который использовался в исследованиях без какой-либо предварительной очистки, Приготовлено1 мл раствора карнозина, для чего было взято около 0,2 мг порошка вещества. Затем кполученному раствору добавили 1 мл раствора гипохлорида натрия и сразу послесмешения измерялась оптическая плотность смеси двух растворов при 292 нм А+ ==0,4177. Затем определяли поглощение раствора гипохлорида натрия при 292 нм бездобавок) параметр Ао = 1,5671). О биологической эффективности карнозина судили попараметру А = (Ао - А+)/Ао, которая для коммерческого карнозина фирмы "Зегча" (США)была равна 0,32+0,04 относительных единицы. Анализ занял около 5 мин, состоял из 20двух операций.Параллельно определению расхода гипохлорида для карнозина фирмы "Яегча"(США) проводили определение антиокислительной активности препарата согласно 25способу-прототипу,Для этого получали сыворотку кровикрысы, на что уходило 50 мин, добавляли 0,2мл ее к 10 мл дистиллированной воды. Затем 5 мг карнозина, растворенного в дистиллированной воде, вносили в полученныйраствор сыворотки. Такой раствор с добавленным карнозином ставили на магнитнуюмешалку и активировали окисление сыворотки внесением в систему 1 мл 60 мМ раствора Ге 304, Через каждые 20 мин отбиралипо 0,8 мл и смешивали с таким же обвемом206 -ной трихлоруксусной кислоты, спустя20 мин от смешения каждую пробу центрифугировали в течение 20 мин при 10000 о, к 40полученному супернатанту добавляли 0,5 о. раствора тиобарбитуровой кислоты (ТБК) икипятили полученный раствор в течение 60мин. Количество ТБК-активных водорастворимых продуктов перекисного окисления 45оценивали по их флуоресценции в области530-580 нм, Для возбуждения флуоресцеиции использовали свет с длиной 515 нм,ширина щели - 3 нм.В качестве контроля использовали 50окисление той же сыворотки без добавления карнозина, Об эффективности препарата судили по величине подавления им вописанной системе ТБК-активных продук 55тов перекисного окисления: В Г 1/Е+)/п, гдеР - интенсивность флуоресценции контроля за 1-тый промежуток времени окисления, Е+ - интенсивность опытного образца (с 2,2 мМ карноэина) за 1-",ый промежуток времени окисления, п - количество измерений, Чем выше эта сумма, тем больше биологическая эффективность препарата карнозина. Точность данного метода зависит от времени проведения анализа: для статически достоверных различий достаточно уже взять четыре пробы, т.е. достаточно проводить окисление в присутствии карнозина в течение 80 мин, Для карноэина фирмы "Яегча" (США), который использовали в исследованиях беэ какой-либо предварительной очии, .стки Х = 1,81 йО,З,Суммарный расход карноэина для такого анализа составлял 5 мг, ингибирующая концентрация в суммарном растворе сыворотки и Ре 304 - 2,2 мМ, время анализа - 3,4 ч, количество операций - 5.П р и м е р 2. Для исследования взят карнозин фирмы "Яегча" (США), который использовался в исследованиях с предварительной очисткой (одна перекристаллизация), Приготовлено 1 мл 2 мМ раствора карноэина, для чего было взято около 0,2 мг порошка субстанции, Затем к полученному раствору добавили 0,8 мл раствора гипохлорида натрия и сразу после смешения измеряли параметр А также, как в примере 1. Этот пример был равен 0,33+0,03 относительных единицы,Анализ занял около 5 мин, состоял иэ двух операций.Для этой же серии карнозина так же, как в примере 1, проводили определение антиокислительной активности препарата согласно способу-прототипу, Параметр Х 1, отражающий антиокислительную активность был равен 1,21+0,2,Суммарный расход карнозина для такого анализа составлял 5 мг, ингибирующая концентрация в суммарном растворе сыворотки и Ре 304-2,2 мМ, время анализа - 3,5 ч, количество операций - 5,П р и м е р 3, Для исследования взят карноэин фирмы "Яегча" (США), который использовался в исследованиях с предварительной очисткой (три перекристаллизации). Приготовлено 1 мл 2 мМ раствора карнозина, для чего было взято около 0,2 мг порошка субстанции, Затем к полученному раствору добавили 0,8 мл раствора гипохлорида натрия и сразу после смешения измеряли параметр А также, как в примере 1, Этот параметр был равен 0,35+0,03 относительных единиц.Анализ занял около 5 мин, состоял из двух операций.Для этой же серии карнозина так же, как в примере 1, проводили определение анти1807353 О, Батдиева ентал Корректор М. Керецман Заказ 1374 Тираж Подписное 8 НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская нэб., 4/5 Производственно-иэдательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 окислительной активности препарата сов,гласно способу-прототипу. Параметр Х,отражающий антиокислительную активность был равен 1,0+0,3.Суммарный расход карнозина для такого анализа составлял 5 мг, 507 ь ингибирующая концентрация в суммарном растворесыворотки и ГеЯ 04 для этой серии образцовне достигалась даже для 100 мМ концентрации карнозина, время анализа - 3,5 ч, количество операций - 5.П р и м е р 4, Для исследования взяткарнозин, выделяемый из мяса крупного рогатого скота по оригинальной методике,разработанной на кафедре биохимии МГУ ивнедренной на Ленинградском заводе медпрепаратов мясокомбината им.С.М,Кирова.Следует отметить, что по сравнению с коммерческим выпускаемым дипептидом, продукт из мяса обладает рядом особенностей,которые позволяют его считать более чистым, лишенным примесей от реагентов химического синтеза. Приготовлено 1 мл 2 мМраствора карнозина, для чего было взятооколо 0,2 мг порошка субстанции, Затем кполученному раствору добавили 1 мл раствора гипохлорида натрия и сразу послесмешения измеряли параметр А также,как в примере 1, Этот параметр был равен 0,31 + 0,06 относительных единиц,Анализ занял около 5 мин, состоял издвух операций.Параллельно определению расхода гипохлорда для кэрнозина из мяса проводи ли биалбггйческое тестирование препаратасогласйб способу-прототипу. Для этого также как,Ь 11 римере 1 определяли параметри,Х 1 = 0,8:М,2, характеризующий эффектив-ность подавления карнозином образованиявторичных перекисных продуктов. Суммарный расход карнозина для такбго анализасоставлял 5 мг, 50 ингибирующая концентрация в суммарном растворе сыворотки кРеЯО для,этой серию образцов не достигалась даже для 100 мМ концентрации карнозина, время анализа - 3,5 ч.,Из приведенных примеров 1-4 можноубедиться, что карнозин, выделяемый иэ мяса крупного рогатого скота, или перекриСоставительРедактор С. Кулакова Техред М.Морг. сталлизованный коммерческий препаратфирмы "Яева" (США) демонтстрировал согласно способу-прототипу даже меньшуюантиокислительную активность по сравнению с неочищенным препаратом фирмы5 "Яегча" (США). С другой стороны, новыйспособ тестирования дает величины А ==032+0 04 0 33+0 03 0 35 йО 03 и0,31+0,06 относительных единиц для разных серий карноэина, что реально отражает10 его антиокислительную активность, так какнеочищенные коммерческие образцы содержат, согласно данным нашего анализа,более высокое содержание химически реак 15 тивных компонентов - антиоксидантов, которые блокируют окисление вспособе-прототипе. По мере очищения синтетического коммерческого карнозина путем перекристаллизации происходит20иуменьшение параметра Х 1, который оценивается в способе-прототипе, но нет статистически значимых изменений параметра Асогласно новому способу, Следовательно,использование способа-прототипа не позволяет с достаточной точностью определять антиокислительную а 4 тивностькарнозина разного происхождения или разных серий. Напротив, по сравнению со спо 30 собом-прототипом новый способ обладаетбольшей точностью,позволяет уменьшитьрасход изучаемого вещества (0,2 мг в новомспособе и 5 мг в способе-прототипе согласно примерам 1 - 4), ускорить 5 мин в новом35 способе и 3,5 ч в способе-прототипе) и упростить способ (2 в новом способе и 5 процедур в способе-прототипе согласнопримерам 1 - 4),40 Формула изобретенияСпособ определения антиокислительной активности карноэина путем добавления окислителя к раствору карнозина с последующей регистрацией оптических 45 свойств пробы, о тли ч а ю щ и й с я тем,что, с целью ускорения и упрощения способа, регистрируют изменения оптической плотности пробы, при 292 нм в качестве окислителя используют гипохлорид на трия;