Способ получения нуклеотидов или олитонуклеотидов — SU 239147 (original) (raw)
О П И С А Н И Е 23947ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических РеспубликЗависимый от патента--аявлспо 02.Х 11.1966 ( риоритет 02.Х 11.1965,116530/23-4 Ел. 2 р, 4/О ,ЧП 1 х С 070 7240-65. Ч Комитет по делам обретений и открыти ри Совете Министров СССРбликовано 1 О969. Бюллетень1 Д 1 547.963,32 (088.8 Дат ликования описания ЗОЛ 11.19 вторызобретения Иностранцы йозеф Моравек и Ян Ш(Чехословацкая Социалистическа ностранное предприятие сЧескословенкодаРеспублика)ска Академие вед,Республика) Заявитель ПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕОТ ОЛ ИГОНУКЛ ЕОТИДОВ ИЛ 2 Идентификацию отдельных в ствля)от с помощью бумажной х При этом получают следующие еств осущсматотр афин. сщества 11 звестен спосоо получения уридилил- (3 - 5)-уридипа, закл 1 очающийся в том, что уридин-фосфат подвергают взаимодействию с дициклогексилкарбодиизНдом; полученный при этом уридин-5-фосрат циклическо о строения обрабатывают дигидропропаном в среде диоксана, образующийся 2-О-тетрагидропираниловый эфир гидролизуют при,натресвании в тидроокиси бария. Полученную смесь 3- и 5-фосфатов обрабатывают трифенил-метилхлоридом в пиридине, при этом выделяется только 3-1)осфорное производное, которое ксндснсируют затем с 2,3-ди-О-ацетилуридином, после чего полученный продукт обрабатываюг щелочью или кислотой. С целью упрощения и удешевления технологии процесса предложен способ получения нуклестпдов или олигонуклеотидов на основе природных и аномальных нуклеозидов, состоящий в том, что нуклеозид или смесь нуклеозидов подвергают взаимодействию с фосфатом щелочного металла в соотношении 1: 1 - 10, преиму 1 цсственно 1:5, при температуре 155 - 165 С с последующей хроматографией полуенной смеси и выделением отдельных нуклеотидов или олигонуклеотидов в чистом виде. Р качестве аномальных нуклеозидов применяют б-азауридин, б-азацитидин, 5-оксиуридин, урацилксилозид, туберцидин. П р псм ср 1. 3.6 г уридина и 11,7 г Ма 11,РО,растворяют в дистиллированной воде и сушатпо )Стод вы)1 с)а)кпв 1 Нпя в колос. Колбс дого)лышк 11 тОгр жают в оано, обогрев)с)11 О5 при температуре 160." С. После нагревания реакционной смеси в течение 1 час ее Охлаждаюти растворяют в воде. Затем отфильтровываютнезначительное количество иерастворившихсяпродуктов и разделяют смесь с помощью ко 10 лонки, заполненной слаоокислой анионообмен 11 О И С М О Л О И, П О ф С Р М И 1 Т Н С ) У Ц И 1. Л 1 Г, О С Р С Д С Т .вом градиентного элюирования по стандартизированной градиентной системе (муравьин)якислота: муравьиная кислота+формиат),15 фракции собирают в автоматически действующий сборник, после чего находят составвещсства путем определения .льтр 1 фи)лстоваго поглощения при 260 )ьттк. Далее обьгдиняют соответствующие фракции по графику из 20 влечения, концснтриру 1 от их, Отдельные вещества осаждают в виде бариевых солей приохлаждении льдом, обрабатывают последовательно охлажденными спиртом, с)Сс)ио э илового спирта с эфиром, эфиром, а затем су 25 шат прод) к н;)д п)1 ти 01 ись 1 О фосфр; (фосфорным ангидридом),Уридили:-(2-:5) -мридип и энди.ил-(Т - :5) -урндпн (7%)Уридин-фосфат (15%)Уридин-фссфат (15%)Крое того, получают 35% урдна в вп;и чистой фракцп.Оппи высд всефосфорлиэсвНнывеществ 62%.П р и м с р 2. 500 лг б-азауридин,5-С620 лг аН,РО, 21-О растворяот в 2 лл дистиллированной воды и сушат в небольшой пробирке по методу вымораживания. -этой робирки погрукают и баню, обогсвасу с при тсмпсратуре 160" С и нагревают 0,5 час. После охлаждения реакционную смесь растворяют в 0,5 лл воды и наносят на лист бумаги, применяемой для хроматографирования. Осуществляют нисходящее хроматографирование с использоваинеем смеси - изомасляная кислота:аммиак:вода (бб:32,5:1,5).Далее удаляют растворитель из бумаги, обдувая ее воздухом, имеющим температуру лабораторного помещения.Для обнаружения веществ используют автоматически действующую аппаратуру для определения распределения активности на полосках роматсграммы, После определения зон отдельные полоски роматограмхы непрерывно элюируют водой, и экстракты, выделенные пз адсорбента, повторно хроматографирук)т, применяя смесь изопропанол: аммиак: вода (7; 1: 2), Очищенные указанным путем вецества элюируют водой и лиофизируют. Г 1 р этом получают следующие вещества,6-Азауридилил- (2 - 5) -6-азауридн6-Лзауридилил-(3 в 5)-б-азауридин6-Лзауридин-фосфатб-Лзауридин-фосфатКроме того, получаот 6-азауриди 60 65 П р и м е р 3. 3 лг б-азауридин,5-14 С и 3 лг б-азацитидина смешивают с 20 лг аНРО р(21-10 и нагревают в пробирке при температуре 160 С в течение 15 лин, причем в баню для обогрева погружают -(з пробирки. По окончании реакции смесь наносят на хроматографичеокую бумагу проводят хроматографирование с применением смеси изопроп- ловый спирт; аммиак: вода (7:1:2) с таким расчетом, чтобы фронт растворителя достигал края оумати. После высушивания хроматограмму дополнительно проявляют (в общей сложности трп раза). Нуклеозид и нук,сотид, ,находящиеся в нижней части хроматограммы, регенерируют путем извлечения из бумаги. Олигонуклеотиды, сконцентрированные в вор- ней части хроматсграммы, элюируют, и элюат выпаривают методом вымораживания (18%). Получают следующие вещества:6-Азауридин-монофосфат6-Лзацитидин-монофосфат,ЛзауридилилазауридинАзауридилазацитидипАзацитидилилазацитидин 510 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Зтвещества имеют 2,5- 3,5-нтсрнуклеотидные связи.П р и м е р 4, 0,3 г 5-гдроксиуридина и 1 г ХаРО,2 Н,О обрабатывают аналогично рмеру 1, но с тем отличием, что нуклеотиды ь юлрсванном виде в.деляот по методу бумажно рсматсграфии на осгп;стаэо.,:тс рфисеко бу.ач. 1 волиэсвапн.е клсот.1 ныс фракции выделяют с 82%-ным выкодом. 11 олучают следующие вещества:Гдрсксиуридплил- (2 - 5) -тидроксиуридин Гидроксиуридпл-(3- 5) -гидроксиуридн Гпдроксиу рди-фосфатдрокспу 1)дин-фссфстГидроксиуридинП р и м е р 5. 2,44 лг уридин-4 С растворяют в 0,1 лл воды и к полученному раствору добавляют 0,1 лл водногс раствора, содержащео 3,24 лг нерадиоактивной уридиловой кслоты. После тщательного перемешивания воду удаляют методом вымораживания. Смесь нагреваот при температуре 160= С в течение 5 лин, причем в сосуде для проведения реакци поддерживают вакуум. Продукт реакции в.дел:ст в чистом виде по пр)ер 3. огмают радиоактивный уридплил- (3-: 5) -уридин (8%), уридилил-(2- 5)-уриян (8%) 30% уридин(3) -фосфат. 1-1 е вошедший в реакию псодный 1 С-уридин регенерируют.П р и м е р 6. 360 лг азацитидина и 1,17 г ХаН.РО. 2 НО обрабатываот, как указано в примере 1, но с тем отличием, что нуклеотиды выделяют по методу бумажной хроматографии ;а шести листах роматографичеакой бумаги. Выход нуклеотидов 65%. Получают следующие вещества:Лза цитидилил- (3-5) -азацитидинЛза цитидилил- (2-5) -азацитидинЛзацитидин(3) -фосфатАзацитидинП р и и е р 7. 350 лг урацилксилозида и 1,2 г МаН,РО, 2 НО обрабатывают, как указано в примере 1, но с тем отличием, что нуклеотиды (выход 26%) выделяют по методу бумажной хроматографии на шести листах хроматографичсской бумаги. Получают урацилксило;ид-монофосфат,Пример 8, 3 лг туберцдина и 16 лг ХаНРО 1 2 НО обрабатывают, как указано в примере 1, о с тем отличием, что нуклсозиды выделяют по методу бумажной хроматографии на одном листе роматсграфической бумаги. Выход нук:естидов 25%. Получают туберцидин-монсфосфат. Предмет изобретения1. Сособ получения ну 1 к,сотидов или олпгонуклеотидов на основе природных и аномальных нуклеозидсв, отличаогцайся тем, что, с целью упрощения технологии процесса, нук,созид или смесь нуклеозидов подвергают об,работке фосфатом щелочного металла в соотииенин 1:1 - 10 при температуре 155 - 165 С с о,ледующей хроматографией полученнойЗаказ 619,3 Тираж 480 Подписное111-ИИП 11 Комитета по делам изобретени и открыти при Совете Министров ССОМосква, Центр, пр. Серова, д. 4ипография, ир. Сап 1 иова, 9 смеси и Выделениеи отдельнггк иуклсотидов и олиг.онуклсотндов В сто Виде.2. Способ по и. 1, отличпюи 1 ггйсн тем, что счссь нуклсозидов и фосфат цслочното металла берут в соотногпении 1:5. 3. Сносно по и. 1, от,гггпгггогг 1 игсг тем, чтов еаГсВс аном 1 ьны. нунлсозидов применяот 6-1 з 1 уридин, б-азацитидин, 5-онсиур 1 днн,урггцилксилозид и туборцидин,5