Способ удаления пирогенных веществ из -аспарагиназы — SU 537114 (original) (raw)
ьфо 8 оо 103- я,я тюнтно-тохннчссиэ библиотек МБА ОП И САНИ Е ИЗОБРЕТЕН И Я ш 1 537 4 Сова Севетекик,социалистических Республик(22) Заявлено 02.09.74 (21) 2058867/13 2 С 12 Р 13/1 С 076 7/О соединение заявкиГосударственный комитет Совета еаинистрав СССР 23) Приоритет публи ано 30.11,76. Бюллетень44 УДК 615.779.94исания 22.12.76 ата опубликовани Авторыизоб етени Л, В. Пояр . К, Звиргз намени ин атвийской га и го Н) СПОСОБ УДАЛЕНИЯ ПИРОГЕННЫХ В ИЗ Е-АСПАРАГИНАЗЫ Т р я Г, И. Клейнер, Р, А. Ж Д. Я. Да(71) Заявитель Ордена Трудового КрасИзобретение относится к медицинскои промышленности, а именно к получению препаратов, которые могут найти применение прилечении злокачественной болезни крови -лей козы, 5Известен способ удаления пирогенных веществ из 1,-аспарагиназы путем сорбированияаминоалкилированными гелями декстрана иразделения хроматографией 1,Известен способ очистки аспарагиназы, заключающийся в том, что раствор сырца подвергают фракционированию полиэтиленгликолем, осажденный фермент растворяют в водеи осаждают целевой продукт спиртами. Осаждение ведут в присутствии полиэтиленгликоля.Кристаллизацию осуществляют, например,при рН 5,2 2.Однако известный способ не обеспечиваетполного удаления пирогенных веществ.С целью более полного удаления пирогенных веществ сырец фермента растворяют вводе при рН 5,2 - 5,6 и полученный раствор непосредственно фракционируют полиэтиленгликолем, выпавший осадок растворяют и целевой продукт кристаллизуют полиэтиленгликолем и изопропиловым спиртом. Для кристаллизации используют полиэтиленгликоль с молекулярным весом 6000 в количестве 0,9 - 2,2%и изопропиловый спирт в количестве 9 - 12%(по объему), а в качестве исходного полуфаб кова, Л. М. Елизаровская,да-Звиргздиняститут органического синтеССР риката берут сырец фермента, содержащии не менее 50 МЕ/мг белка.Пример 1, 5 г лиофилизированного сырца 1.-аспарагиназы с удельной активностью 72 МЕ/мг белка растворяют в 70 мл апирогенной воды, подкисляют до рН 5,2 - 5,4 2 М уксусной кислотой, охлаждают до 2 - 5 С и добавляют при перемешивании 50%-ный водный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) молекулярного веса 1500 до 5%-ного содержания. После 10,мин выдержки раствор центрифугируют в течение 20 мин при 5000 об/мин и осадок отбрасывают, К надосадочной жидкости добавляют 50% -ный раствор ПЭГ до 10%, осадок отделяют центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20 мин, растворяют его в апирогенной воде до концентрации белка 35 - 40 мг/мл, подщелачивают до рН 6,5 - 7,0 и нерастворимую часть центрифугируют. Полученные 45,8 мл раствора с удельной активностью 172 МЕ/мг белка подкисляют до рН 5,2 - 5,5 0,5 М уксусной кислотой, добавляют при перемешивании 50%-ный водный раствор ПЭГ молекулярного веса 6000 до 0,7%, изопропиловый спирт до 5% и выдерживают 18 - 20 час при 2 - 5 С. Выпавший кристаллический осадок отделяют центрифугированием в течение 20 мин при 5000 об/мин, растворяют в воде до содержания белка 35 - 40 мг/мл, ус537114 Таблица 1 Удельнаяактивностьфермента,МЕ/мгбелка Пирогенность при введении1000 МЕ/мг веса кролика Выход фермента, % от исход- ного Выход по белку, 00 от исход- ного Всегобелка,мг ВсегоМЕ, 10 з Объект исследования 2,0 1,6 1,0 0,3 0,3 1,8 1,4 0,6 0,2 0,2 1,8 1,2 0,5 0,5 0,2 72,5 172 180 185 200 348 273 144 74 54,7 100 79 41,3 21,2 15,7 100 33 16,7 8,3 5,74800 1590 800 400 273 Исходный материалфракцияПервая кристаллизацияВторая кристаллизацияТретья кристаллизация Таблица Пирогенность при введении 1000 МЕ/г веса кролика15800 5650 2950 1340 632 790 676 522 268 197 Исходный материалфракцияПервая кристаллизацияВторая кристаллизацияТретья кристаллизация 10035,718,78,54,0 танавливают рН 6,5 - 7,0 и снова центрифугируют. Получают 17,8 мл раствора с удельной активностью 180 МЕ/мг белка.Аналогичным образом проводят вторую кристаллизацию. Получают 9,7 мл раствора /.-аспарагиназы с удельной активностью 185 МЕ/мг белка. После третьей кристаллизации получают 2,64 мл раствора с удельной активностью 200 МЕ/мг белка.Проводят испытание на пирогенность, ПриП р и м е р 2. 20 г лиофилизированного сырца Е-аспарагиназы с удельной активностью 50 МЕ/мг белка растворяют в 230 мл апирогенной воды, подкисляют до рН 5,2 - 5,4, охлаждают и фракционируют раствором ПЭГ молекулярного веса 1500 как указано в примере 1. Осадок, выпадающий при концентрации ПЭГ 5 - 10/о, растворяют и центрифугируют. Получают 173 мл раствора с удельной активностью 120 МЕ/мг белка. Проводят последовательно первую, вторую и третью кристаллизации аналогично примеру 1, с той разПример 3. 20 г лиофилизированного сырца 1,-аспаратиназы с удельной активностью 82 МЕ/мг белка растворяют в 230 мл воды и фракционируют водным раствором ПЭГ молекулярного веса 1500 аналогично примеру 1. Осадок, выпадающий при концентрациями ПЭГ 5 - 10 о/растворяют и центрифугируют. Получают 197 мл раствора с удельной активностью 170 МЕ/мг белка, Кристаллизацию проводят как в примере 1, с той разницей, что вносят 4нятая тест-доза равняется 1000 МЕ на кг веса кролика.Раствор 1,-аспарагиназы, полученный растворителем кристаллического вещества в воде, разводят до концентрации 1000 МЕ/мл, вносят в качестве стабилизатора глицин в количестве 18,9 мг/мл, отфильтровывают через мембранный фильтр и лиофилизируют,Результаты испытания на пирогенн ость 10 представлены в табл. 1. ницей, что вносят каждый раз 50%-ный раствор ПЭГ молекулярного веса 6000 до 1%, а изопропиловый спирт - до 10%.После первой кристаллизации получают86 мл раствора с удельной активностью 177 МЕ/мг белка. После второй кристаллизации получают 4,2 мл раствора с удельной активностью 200 МЕ/мг белка, после третьей кристаллизации раствор имеет удельную ак тивность 205 МЕ/мг белка.Результаты испытания на пирогенностьпредставлены в табл. 2. каждый раз 50 о/о-ный раствор ПЭГ молекулярного веса 6000 до 1,5%, изопропиловый спирт до 15/о. После первой кристаллизации получают 93 мл раствора с удельной активностью 180 МЕ/мг белка. После второй кристаллизации препарат имеет удельную активность 170 МЕ/мг белка, после третьей кристаллизации - 180 МЕ/мг.Результаты испытания на пирогенность представлены в табл. 3.537114 Таблица 3 Удельнаяактивностьфермента, МЕ/мг белка Пирогенность при введении 1000 МЕ/мг веса кроликаВыход фермента, % от исход- ного Выход по белку, % от исходно- го Всегобелка,мг ВсегоМЕ, 10 Объект исследования 1,8 1,4 0,8 0,8 0,1 1,7 1,2 0,7 0,6 0,4 100 97 57,8 35,1 21,21,4 1,1 1,1 0,5 0,2 14500 6600 3820 2460 1400 Исходный материалфракцияПервая кристаллизацияВторая кристаллизацияТретья кристаллизация Таблица 4 Удельнаяактивностьфермента,МЕ/мгбелка Пирогениость при введении 1000 МЕ/мг веса кроликаВыход фермента, % от исход- ного Выход по белку, % от исход- ного Всегобелка,мг ВсегоМЕ, 103 Объект исследования Исходный материалфракцияПервая кристаллизацияВторая кристаллизацияТретья кристаллизация 1160 740 575 390 222 100 34 24,8 16,9 10,1 100 64 49,6 33,6 19,2 2,0 1,6 0,9 0,8 0,5 1,9 1,7 1,0 0,8 0,6 110 200 210 210200 1,7 1,4 1,3 0,7 0,4 110003730 2720 1860 1100 П р и м е р 4. 20 г лиофилизированного сырца 1 аспарагиназы с удельной активностью 110 МЕ/мг белка растворяют в 230 мл воды и фракционируют водным раствором ПЭГ молекулярного веса 1500 аналогично примеру 1.Осадок, выпадающий при концентрации ПЭГ 5 - 10% растворяют, нерастворимую часть отделяют центрифугированием. Получают 175 мл раствора с удельной активностью 200 МЕ/мг белка, Проводят три последовательные кристаллизации как в примере 1, с Предлагаемый способ обеспечивает возможность получения противолейкозного лекарственного средства Е-аспарагиназы. Формула изобретения1, Способ удаления пирогенных веществ из Е-аспар агин азы микробного происхождения путем фракционирования сырца фермента полиэтиленгликолем, отл и ч а ю щи й с я тем, что, с целью более полного удаления пирогенных веществ, сырец фермента растворяют в воде при рН 5,2 - 5,6 и полученный раствор непосредственно фракционируют полиэтиленгликолем, выпавший осадок растворяют и целевой продукт кристаллизуют полиэтиленгликолем и изопропиловым спиртом,той разницей, что вносят каждый раз 50%-ный раствор ПЭГ молекулярного веса 6000 до 2,2%, изопропиловый спирт - до 10/О, а кристаллический осадок первой, второй и третьей кристаллизации дважды промывают двойным объемом ацетона и высушивают до постоянного веса в вакуум-сушильном шкафу при температуре 40 С и остаточном давлении 30 - 40 мм рт, ст.10 Результаты испытания на пирогенностьпредставлены в табл. 4. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что для кристаллизации используют полиэтиленгликоль с,молекулярным весом 6000 в количестве 0,9 - 2,2 /О и изопропиловый спирт в количестве 9 - 12% (по объему).3. Способ по п. 1 - 2, отл ич а ющийся тем, что в качестве исходного полуфабриката используют сырец фермента, содержащий не менее 50 МЕ на мг белка. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:1. Патент США Мя 3634196, кл. 195 в 6, 1973 (аналог).2. Патент Франции Уя 1598881, кл. С 07 Ст 7/02, 1970 (прототип).