Способ получения глюкоамилазы — SU 912753 (original) (raw)
О П И С А Н И Е 119:12753ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистическихреспублик(53)М. Кл,(22) Заявлено 02.07,80(21) 2950559/28-13 с присоединениеи заявки М С 12 й 9/343 Ъеударстаеииы кекитет СССР аф деаи изобретеиий и открытий) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛОКОАИИЛАЗЫ зыв среИзобретение относится к ферментной отрасли микробиологической про-:мышленности и может быть использо-вано при производстве ферментных препаратов глюкоамилазы на основе глу"бинного способа культивирования.Известны способы получения.фермен"тов позволяющие интенсифицироватьпроцесс культивирования продуцентовпутем дробной подачи питательных веществ.3При .получении цефалоспорина куль-,турой Бйгерсовусеэ сачцсегцз уста-новлено что аммонийный азот усилива- .У: 15ет рост микроорганизма, но ингибиру-ет антибиотикообразование ,11,Ийгибирующее действие солей аммо"ния на образование антибиотика ска"ается лишв при добавлении их к;дам в начале ферментации или че-.20рез 24 ч, а более позднее добавление не сказывается на продуцирующуюспособность микроорганизма, те, со" ли аммония не связаны неоосредственно с механизмом биосинтеза,Известен способ получения глюкоамилазы при глубинном культивирова"нии продуцентов из рода Азрегд 1 Ицзна питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и стимуляторы биосинтезаферментов, где предусматривается добавление в процессе роста продуцентааммонийного азота в виде газообразного или водного раствора аммиака,количество которого регулируется поддержанием величины рН культуральнойжидкости в пределах 5,5 ф 0,2. Приэтом конечная активность в культуральной жидкости повышается на 803по сравнению с подачей аммонийногоазота в виде (МН 4)НРО 4, в количестве1,ОЗ непосредственно в питательнуюсреду перед началом культивирования 21,Недостатки известного способа заключаются в том, что основное воздей3312 75ствие аммониййого азота на культуруосуществляется только в стадии актив-:ного роста культуры не учитываютсяоптимальные концентрации азота наразных стадиях роста и развития продуцента 1 не обеспечивается оптималь"ное соотноаение углерода и азота вначальном периоде образования биомассы не создаются условия для мак"симального накопления глюкоамилазы в 10конце культивирования.Цель изобретения - увеличение выхода и активности глюкоамилаэы и сок"ращение срока культивирования продуцента. 1Поставленная цель достигается тем,что согласно способу получения глюкоамилазы, предусматривающему глубинное культивирование продуцентов из,рода Азрегд Ицв на питательной сре- Оде, содержащей источник углерода, источник аммонийного азота, минеральныесоли и стимуляторы биосинтеза ферментов, в процессе культивированияконцентрацию аммонийного азота в сре-.,де изменяют постадийно; источник аммонийного азота вводят в количестве0,1-0,4 г/л на стадии экспоненциального роста культуры до начала активного синтеза глюкоамилазы, в периодЗОактивного синтеза фермента концентрацию аммонийного азота увеличиваетдо 0,25-1,0 г/л, а по окончании синтеза фермента до начала автолизакультуры снижают до 0,05-0,5 г/л пу"тем разбавления культуральнои жидкос- .ч35ти стерильной водой,В качестве источника аммонийногоазота используют двузамещенный фосфорнокислый аммоний или трехэамещенч ч40ныи фосфорнокислыи аммоний, или гидро"окись аммония, или аммониевые солимолочной или лимонной кислот, илиаммонийные поликарбоновые кислоты,которые вводят в культуральную жидкостьв виде стерильных растворов.Способ осуществляется следующимобразом.Готовят питательную среду, содержащую,Ф: кукурузная мука 7, кукурузный крахмал 5, БВК 2,0 и (МН)НРО, фо0,05-0,2. После стерилизации и охлаждения среду, в которой содержится0,1-0,4 г/л аммонийного азота, засевают посевным материалом грибов изрода АзрегуИоз. После 24 ч культи- ффвирования в культуральную жидкостьвводят источники аммонийного азота ввиде стерильного раствора в количест 3 4вах, обеспечивающих концентрациюаммонийного азота на стадии активного биосинтеэа, в пределах 0,251,0 г/л. После 60"90 ч культивирования к культуральной жидкости добавля"ют 20"30 ь стерильной воды, снижая таким образом концентрацию аммонийногоазота в среде до 0,05-0,5 г/л, Культивирование продолжают до максимального накопления глюкоамилазной ак".,тивности (72-110 ч роста).П р и м е р 1 контроль). В биолафит емкостью 50 л загружают при ко-,эффициенте заполнения 0,5 питательную среду с оптимальными соотношением компонентов,3: мука кукурузная 7,крахмал кукурузный 5, БВК 2,0,(В 3 ) НРО 0,1. После стерилизациии охлаждения среды, в которой содержится 0,2 г/л аммонййного азота,производят засев посевным материаломгриба АБрегд 133 цэ п 1 дег 1-33Культивирование продуцента глюкоамилазь 1 осуществляют в течение 140 ч с подачейраствора аммиака (ИНОН) до поддержания рН в процессе культивированияна уровне 5,5 Ф 0,2. Активность глюкоамилаэы в конце культивирования со-,ставляет 80 ед/мл.П р и м е р 2. Подготовку и эа-.сев питательной среды осуществляюткак в примере 1, но начальная кон"центрация аммонийного азота в средесоставляет 0, 1 г/л за счет добавления 0,54 ИН)РО 4. В качестве продуцента используют посевной материалАэрегдИцз аиааог.После 24 ч культивирования вкультуральную жидкость вводят стерильный раствор СдНОНМН, в количестве, поддерживающем концентрациюаммонийного азота в пределах 0,25 г/лдо 60 ч роста, затем в культуральную жидкость добавляют 204 стерильной воды до содержания аммонийногоазота 0,05 г/л и культивирование продолжают до 72 ч роста. Конечная активность в культуральнай жидкости126 ед/мл.П р и м е р 3, Подготовку и засев питательной среды проводят аналогично примеру 2 за исключением начальной концентрации аммонийного азота в среде, которая составляет0,4 г/л за счет добавления 0,2(йН)НРО,После 24 ч культивирования, когдаконцентрация аммонийного азота снижается до 0,2 г/л, в культуральную жидФормула изобретения 30 Составитель Е.ВоробьеваРедактор Л. Веселовская Техред Е, баритончик Корректор С.Шекмар Заказ 1316/35 Тираж 505 . Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и.открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,5 9127 кость добавляют стерильный раствор СЬНФ 07 ИН 4 в количестве, обеспечивающем содержание аммонийного азота 0,6 г/л. После 60 ц культивирования в культуральную жидкость добавляют 5 30 стерильной воды и культивирование продолжают до 90 ч роста, Конецная активность глюкоамилазы в культу- ральной жидкости составляет 138 ед/мл.Таким образом, предложенный спо О соб получения глюкоамилазы позволяет сократить срок выращивания продуцентов глюкоамилазы на 30-69 ч за счет ускорения роста биомассы в начале процесса, повысить глюкоамилазную ак тивность в культуральной жидкости на 17-58 ед/мл.и, соответственно, ;выход целевого продукта на 8-29 усл.кг за .сцет интенсификации накопления глюкоамилазы в период активного био синтезами. снизить удельный расход компонентов питательной среды в ,1,2- 1, 3 раза за сцет увеличения продуктивности процесса.Ожидаемый экономический эффект 25 составляет 418,55 тыс. руб. Способ получения глюкоамилазы путем глубинного культивирования продуцентов из рода Азрег 91 ицз на питательной среде, содержащей источник уг. лерода, .источник аммонийного азота, минеральные соли и.стимуляторы биосин 53 бтеза ферментов, о т л и ч а ю щ и йс я тем, цто, с целью увеличениявыхода и активности глюкоамилазы и,сокращения срока культивирования продуцента, в процессе культивированияконцентрацию аммонийного азота в среде изменяют постадийно: источникаммонийного азота вводят в количестве 0,1-0,4 г/л на стадии экспоненциального роста культуры до началаактивного синтеза глюкоамилазы, в период активного синтеза фермента концентрацию аммонийного азота увеличивают до 0,25-1 г/л, а по оконцаниисинтеза фермента до начала автолизакультуры снижают до 0,05-0,5 г/лпутем разбавления культуральной жид"кости стерильной водой,2, Способ по и. 1, о т л и ц а ющ и й с я тем, что в качестве источ"ника аммонийного азота используют двузамещенный фосфорнокислый аммоний илитрехзамещенный фосфорнокислый аммоний,или гидроокись аммония, или аммониевые соли молочной или лимонной кислот,или аммонийные поликарбоновые кислоты, при этом в культуральную жидкость их вносят в виде стерильныхрастворов.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Сапад 1 ап .Соцгпа В оГ И 1 сгоЬ 1 ооЯУю 1979 25, М 1, 61-67.2. Патент США й 3660236 укл, С 12 0 13/10, опублик. 1972 (прототип),