Способ определения фосфолипидов в биологическом объекте — SU 1334083 (original) (raw)
(57) Ине, прфосфолке. Цел ФОСФО СОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЧЕСКОМ ОБЪЕКТЕ бретение относи назначено для о идов в лаборато изобретения ся к медициределенияной практискорение спофата натрия. 2 табл ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТ(56) Апа 1 у тса 1 ЪосЬешч. 104, р, 10-14. соба. К пробе белка субклеточных фракций печени крысы прибавляют пробу смеси метанол-хлороФорм (1: 1) иоупаривают досуха при 40 С.К сухому остатку прибавляют пробу толуола и параллельно такое же количество добавляют в пробирку (холостой опыт) и нагревают 30 с при 30-50 С, затем добавляют раствор ферротиоцианата ам мония и 1 мин размешивают на миксере, После расслоения фаз из верхней толуоловой фазы отбирают пробу и фотометрируют при 448 нм на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре с соответствующим фильтром против холостой пробы. Для осветления мутного толуолового слоя добавляют несколько кристаллов безводного суль Изобретение относится к медицинеи может быть использовано для опре"деления фосфолипидов в лабораторнойпрактике,Цель изобретения - ускорениеспособа путем совмещения процессовэкстракции фосфолипидов и высушивакия экстракта,П р и м е р 1. К 0,25 мг белкасубклеточных фракций печени крысыприбавляют 1,5 мг смеси метанол-хлороформ в соотношении 1:1 и упариваоют досуха при 40 С (слецы метанолазавышают результаты определенияфосфолипидов),К сухому остатку прибавляют 3 млтолуола (параллельно в пробирку наливают 3 мл толуола - холостой опыт 7и нагревают 30 с при 50 С, затемприбавляют 2 мл раствора Ферротиоцианата аммония (27,03 г гексагидрата хлорного железа и 30,4 тиоцианата аммония растворяют в 1 л воды) ивстряхивают в течение 1 мин или раз,.мешивают на миксере.После расслоения фаз из верхнейтолуоловой фазы отбирают пробу и Фотометрируют при 448 нм на спектрофотометре или фотоэлектроколориметрес соответствующим фильтром, противхолостой пробы. Кювета не должна содержать воду, Если толуоловый слоймутный, то кювету можно нагреть втеплой воде или добавить несколькокристалликов безводного сульфатанатрия,П р и м е р 2. К 1 мг белка суб-. клеточных фаркций печени крысы прибавляют 15 мл смеси метанол.-хлороформ в соотношении 1: 1 и упариваютодосуха при 70 С (следы метанола завышают результаты определения фосфолипидов),К сухому остатку прибавляют 3 мл толуола (параллельно в пробирку на-. ливают 3 мл толола - холостой опыт) и нагревают 60 с при 60"С, затем прибавляют 2 мп раствора ферротиоцианата аммония (27,03 г гексагидрата хлорного железа и 30,4 тиоцианата аммония растворяют в 1 л воды) и встряхивают в течение 1 мин или размешивают на миксере.После расслоения фаз из верхней толуоловой фазы отбирают пробу и фотометрируют при 448 нм на спектроФотометре или фотоэлектроколориметре с соответствующим фильтром против хо 83 2лостой пробыКювета не должна содержать воду, Если голуоловый слоймутный, то кювету можно нагреть втеплой воде или добавить несколькокристалликов безводного сульфатанатрия,П р и м е р 3. К 0,1 мл сыворотки крови прибавляют 1,5 мл смеси метанол-хороформ в соотношении 1: 1ои упаривают досуха при 70 С (следыметанола завышают результаты определения фосфолипидов) .К сухому остатку прибавляют 3 млтолуола (параллельно в пробирку наливают 3 мл толуола - холостой опыт)и нагревают 60 с при 60 С, затемприбавляют 2 мл раствора ферротиоцианата аммония (27,03 г гексагидрата хлорного железа и 30,4 грамматиоцианата аммония растворяют в1 л водь 1) и встряхивают в течение1 мин или размешивают на миксере,После расслоения Фаз из верхнейтолуоловой Фазы отбирают пробу в кювету и Фотометрируют при 448 нм наспектрофотометре или фотозлектроколориметре с соответствующим фильтромпротив холостой пробы. Кювета недолжна содержать воду. Если толуоловый слой мутный, то кювету можнонегреть в теплой воде или добавитьнесколько кристалликов безводногосульфата натрия.,П р и м е р 4. Э табл.1 и 2приведены данные по сравнению метоца Стеварта ГБ) с предлагаемым способом (А). 340 10 20 но,Предлагаемый способ количественного определения Фосфолипидов по 45 сравнению с известньпйи сокращаетвремя анализа с 48 до 1-2 ч, упрощает методику исключая из нее процесс отмыьки и дозированный отборпроб, а также уменьшает количество 5 О Фосфолипида, необходимое для минимальных определений. формула и з о б р е т е н яСпособ определения Фосфолипидов в биологическом объекте., включающий экстракцию Фосфолипидов смесью хлороформ-метанол, паривание экстракта с последующей реэкстракцией Аосфолипидов, обработкой полученПри сравнении специфичности предц 0 .лагаемого способа и способа-прототипа каких-либо различий не выявлез1334083ного продукта раствором ферротиоци- си досуха при температуре от 40 С аната аммония и фотометрированием, до температуры закипания экстрагио т л и .ч а ю щ и й с я тем, что, рующей смеси, а реэкстракцию проводят с целью ускорения способа, экстракцию . при нагревании в течение 30-60 с5 о проводят в процессе упаривания сме- и температуре 50-60 С. Таблица 1 Сравнение предлагаемого. способаопределения фосфолипидов (А) сметодом Стеварта (Б), и = 10 Микросомы печени крыс, мкг/мг белка ПоказательСыворотка крови человека, мг/л без добавкифосфатидилхолина без добавкифосфатидилхолина АВ А Б А Б А Б 2000 3113 2913 120 108 209 266 381358 2135 284 81 9,1 14,0 4,7 69 3,1 7,2 3,2 40 36 5,3 3,8 5,9 3,5 7 открытия добавки 97,8 91,3 97,0 92,0 Таблица 2 Вещество (100 мкг) Оптическаяплотность АВ Фосфатидилхолин 0,270 0,270Триолеин 0 0 с добавкойфосфатидилхолина(100 мкг/1 мл) Специфичность определенияфосфолипидов при сравнениипредлагаемого способа (А)с методом Стеварта (Б)Заказ 3958/42 Тираж 776 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д,4/5