Способ очистки человеческого фибробластного интерферона — SU 1389667 (original) (raw)
,. 13 ОТди,",ИБЯ.1 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ ПАТЕНТ 14нкорпорейт осои и Хитоси Озава(088.8) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(53) 664.38 56) Л.Вдо 1 СЬев, 252, р.5934; 1 54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОИБРОБЛАСТНОГО ИНТЕРФЕРОНА(57) Изобретение относится к медицине. Цель изобретения - повышениепроизводительности процесса. Подкисленный раствор интерферона пропускают через колонку с поперечносшитым декстраном. Интерферон элюируют фосфатным буфером. Часть элюента пропускают через колонку с металлхелатным носителем. Затем интерферонэлюируют раствором гистидина с хлористым натрием. Полученный элюентсодержит незначительное количествопирогенных веществ, соответствующеетребованиям для биологических веществ, 2 табл.25 Изобретение относится к медицинеи касается способа очистки человеческого Фибробластного интерферона.Целью изобретения является повы 5шение степени очистки человеческогофибробластного интерферона, котораядостигается за счет хроматографиина поперечно сшитом декстране, содержащей сульфонильные группы, ина производных агарозы, включающихкарбоксиметиламиногруппу и ион Са,или Мх , или Еп, или Сц+Способ осуществляют следующимобразом. 15Раствор человеческого Фибробластного интерферона с рН 1-3 пропускаютчерез колонку с БР-сефадексом, колонку промывают водой, элюцию интер"Ферона осуществляют при рН 7,0-11,0 20и затем через колонку с эпоксиактивированной сефарозойВ, содержащейбискарбоксиметиламиногруппу, а вкачестве иона металла Са +ф, илиИд, или Еп ф, или Си, элюциюинтерферона осуществляют растворомгистидина.П р и м е р 1. Интерферонсодержацую жидкость готовят обработкойчеловеческих фибробластных клеток 30(супериндукция).35Раствор интерферона (рН 7,4),имеющий активность интерферона3200 МЕ/мл и концентрацию белка20 мкг/мл, доводят до рН 2,0 солянойкислотой и пропускают через колонку 40с поперечно сшитым декстраном, содержащим сульфонильную группу, БР -сефадексом (200 мл, 4,6 см х 12 см)После пропускания 60 л раствора,содержащего интерферон (с общей активностью 1,9 х 10 ИЕ), колонку про 8мывают 2 л воды. Элюат содержал9,5 х 10 ИЕ (57) активности интерферона. Колонку затем промывают 0,1 ИИа-Фосфатным буфером при рН 8,3,50причем интерферон выходил в первых2 28 л элюента. Эта фракция содерУ9жала 1,8 х 10 ИЕ (943) активностиинтерферона и 23 мг белка, Удельнаяактивность была 8 х 10 МЕ/мг, белка.655Концентрация составляла 26 раз истепень очистки 50 раз,Носитель для металл-хелатнойхроматографии приготавливают по методу Пората. Имидоуксусную кислоту(100 мл) в течение 4 ч при 56 С,фильтруют, промывают и хранят при4 С.Колонку для Еп - хелатной хроматографии (45 мл, 3 см х 6,4 см)приготавливают пропусканием 17-ногораствора хлорида цинка через носитель в колонке. Через эту колонкупропускают 2,28 л элюента с колонкис БР-сефадексом и 800 мл физиологического раствора. Раствор, который проходил через колонку, и промывной раствор содержали 8 х 10ИЕ(4 Е) активности интерферона. Колонку затем промывают 0,1 И растворомИа-фосфатного буфера (рН 4,5), содержащим физиологический раствор(72%) активности интерферона. Концентрация интерферона в этой Фракции была 5,3 х 10 ИЕ/мл и концентрация белка - 2 мкг/мл с удельнойактивностью 2,7 х 10 ИЕ/мг белка,6что указывает на очистку в 1700 рази концентрацию в 166 раз по сравнению с исходным раствором.Исходный раствор интерферона,содержащий пирогенные вещества, давал положительную реакцию при проверке по Лимулюс-тесту. Часть пирогенных веществ после прохождения черезБР-сефадекс без снижения активностиинтерферона снова давала положительную реакцию при проверке по Лимулюстесту. Оставшиеся пирогенные вещества не задерживались на Еп -хелатной колонке и удалялись в процессепропускания через колонку и промывания. Элюент с металл-хелатной колонки содержал незначительные количества пирогенных веществ,Часть конечной фракции элюентапосле фильтрации через 0,2 ммкфильтр вводили внутривенно трем кроликам (1,5.х 10 ИЕ/кг веса тела).Сумма повышения температуры составляла 0,63 С,П р и м е р 2. В качестве исходного раствора интерферона используютинтерферон, подобный по примеру 1.Подкисленный раствор интерферона(концентрация в 20 раз и очистка в 110 раэ). Часть элюента из колонки сБР-сефадексом (200 мл с активностью2 х 10 , содержанием общего белка10 мг) пропускают со скоростьюг8 мл/ч через колонку с 2 мл Соффхелатного носителя. После промывания20 мп воды и 20 мл Физиологическогораствора интерферон элюируют 0,2 Ираствора гистидина, содержащим0,2 И хлористого натрия рН 7,5. Элюент (6,0 мл) содержал 2,3 х О ИЕ/мл6интерферона (общая активность,13,8 х 10 ИЕ/693) и 15 мкг/мп белка 25(общее количество белка 0,09 мг,выход 0,9 Х, Удельная активность этойфракции составила 1,5 х 10 ИЕ/мгбелка, концентрация составила 460раз, очистка - 750 раз по сравнениюс исходным раствором интерферона.П р и м е р 3. Способ осуществляется согласно примеру 2 за исключением того, что используют И 1 -хек флатную колонку вместо Со -хелатныйколонки,Элюент (6,0 мл) содержал 2,3 мл хх 10 ИЕ/мл (выход 693) и 50 мкг/млбелка (выход 37). Удельная активность составляла 5 х 10 ИЕ/мп бел 7ка.П р и м е р 4. Способ осуществляется согласно примеру 2 эа исключе-.нием того, что Еп -хелатная колоннка используется вместо Со +-хелат 45ной колонки.Элюент (6,0 мл) содержал 2,3 хх 10 МЕ/мп (выход 693) и 30 мкг/мпбелка (выход 1,87). Удельная активность 8 х 10 МЕ/мг белка.П р и м е р 5. Способ осуществляют согласно примеру 2 за исключением того, что Сц -хелатная колонка используется вместо Со-хелатной колонки.Элюент (6,0 мп) содержал 1,8 хх 10 МЕ/мл (вькод 54 ) и 150 мкг/мпбелка (выход 9 Х). Удельная активность 1,2 х 10 МЕ/мг. П р и м е р 6, Элюцию интерферона с колонки с БР-сейадексом проводят при рН 11,0,Исходный интерферон в средеИгла-Мем с общей активностью3,2 х 1 О ЫЕ, общим белком 89 мг,удельной активностью 3,6 х 10 МЕ/мг5доводят до рН 2,0 добавлением 6И НС 1, затем смешивают с 3,0 гБР-сефадекса С(РЬаппас 1 а) и перемешивают в течение ночи при 4 С.После отстаивания в течение 3 ч супернатант удаляют и БР-сейадекс промывают 3 раза 50 мл дистиллированной воды. Суспензию БР-сефадекс(объем в набухшем состоянии около20 мп) в 40 мп дистиллированной воды разделяют между 20 пластиковымипробирками. В каждую из этих пробирок прибавляют по 10 мп О, 1 М Фосйата натрия (одноосновного, двухосновного или трехосновного),доводярН соответственно до 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Пробирки, содержащие ЯР-сейадекси фосйатный буйер для перемешиваниятщательно, встряхивают в течение1 ч и супернатант из каждой пробирки пропускают через Фильтр 0,2 ммк.После этого определяют активностьинтерферона в 10; фнльтратах (см.табл. 1),Интерйерон элюируется при рН 7,011, О.П р и м е р 7. Интерйерон в 0,1 Мрастворе Фосфата натрия (рН 7,6)16 мп с общей активностью 8 х 10 МЕ,общим белком 8 мг удельной активСкостью 10 х 10 ИЕ/мг белка, элюированный с ЯР-сефадекса, пропускаютчерез колонку с Еп-хелатной агарозой в количестве 2 мп и колонкупромывают О, 1 М раствором йосйатанатрия и дистиллированной водой.После этого Еп+ -хелатную агарозуразделяют на 4 порции и помещаютв 4 пластиковые пробирки. В каждуюпробирку прибавляют 5 мп забуйеренного 0,2 М раствора ацетата натрия,содержащего хлорид натрия в концентрации 1 М и имеющего рН соответственно 1,5; 3,0; 4,5; 6,0, тщательно перемешивают в течение несколь.ких минут и определяют активностьинтерферона в каждой пробирке(см. табл.2).Интерферон элюируется при рН 3,05,5.5 138966По известному способу объем 2 пф+- хелатного носителя применяется для очистки 14 объемов интерферона, а в предлагаемом способе 1 объем но 5 сителя применяется для очистки1000-6000 объемов интерФерона. Формула изобретения10Способ очистки человеческого Фибробластного интерферона, путем металл-хелатной хроматограФии, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения производительности процесТ рН ИнтерФерои,ИЕ Выход,Х Удельная активность, ИЕ/мг белка 0,6 с 0,6 0,6 0,6 26 47 9,9 х 10 41 7,4 х 10 2,5 х 10 1,3 х 10 35 11 2,5 х 10 12 1,4 х 10 Таблица 2 рН Активность интер- Выход активФеронов, ИЕ х 10 ности, 7Удельная активность,ИЕ/мг белка х 10 0,2 1,5 10 0,2 0,7 60 1,2 3,0 100 1,0 4,5 2,0 0,6 70 1,4 10 0,1 0,2 6,0 к Для доведения рН используют соляную кислоту. 3 9 х 10 4 9 х 10 5 1,0 х 10 б 2,7 х 10 7 4,2 х 10 8 7,5 х 10 9 6,6 х 10 10 5,6 х,10 са, предварительно проводят хроматограФию на поперечно сшитом декстране, содержащем сульФонильную группупри рН элюции 7,0-11,0, а хелатнуюхроматограФию осуществляют с использованием производного агарозы,содержащей бискарбоксиметиламиногруппу, а в качестве иона металлаион Со, или М., или 2 п+ илиСи+, причем элюцию проводят раствором гистидина в случае Со,Юд, 2 п, или Сц+фили кислым раствором с рН 3,0 - 5,5 в случае2 п-хелатной хроматограФии.а б л и ц а 1 Не определяли Не определяли0,5 х 10 О, б х 10 6,8 х 1011,0 х 10