Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus продуцент моноклонального антитела к фактору некроза опухолей-альфа человека (original) (raw)
СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНРЕСПУБЛИК 19) И 1) 1)4 С 12 И А А 61 К 39/395 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕА ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Белорусский научно-исследоватеский институт переливания крови,Институт молекулярной биологии АНи Институт биоорганической химииим. М.М.Шемякина(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ МОЯ.МИСАИЛ,И-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА К ФАКТОРУ НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ-АЛЬФА ЧЕЛОВЕКА(57) Изобретение относится к области гибридомной технологии. Цель изобретения - получение гибридного штамма, продуцирующего моноклональное антитело (мон АТ) к фактору некроза опухолей-альфа (ФНО-Ы) человека, обладающее биохимической однородностью и высокой специфичностью, Штамм депонирован под номером ВСКК/П У 130. Штамм продуцирует мон АТ 1 я С 1 - изотипа, связывающееся с ФНО- о(человека. Содержание мон АТ в 1 мл культуральной среды и 1 мл асцитной жидкости составляет соответственно 14-20 мкг и 5-7 мг. Продукция антитела сохраняется как минимум в течение 15 пассажей в куль- , а туре. Мон АТ штамма гибридомы могут быть использованы для иммуносорбции Р ФНО-Ы, а также для очистки последнего. 2 табл.150779Изобретение относится к гибридомнй технологии.Цель изобретения - получение гибридного штамма, продуцирующего монокло 5 н льное антитело (мон АТ) к фактору н кроза опухолей-альФа (ФНО) чело- в ка, обладающего биохимической однор дностью и высокой специфичностью.Штамм получают следующим образом. 10Иьппей линии ВА 13/С иммунизируют по 21 недельной схеме. 20 мкг Р НФО-а в 0 15 М ХаС 1 в смеси с равным объемом п лного адьюванта Фрейнда дважды вво" д т внутрибрюшинно с интервалом в " 15 7 дней, За 3, 2 и 1 день до слияния 1 мкг Р ФНО-о вводят внутрибрюшинно0,5 мл 0,15 М ИаС 1, Гибридизацию 1,2 х 10 клеток селезенки иммунныхппей и 4 х 10 клеток миеломы мыши 63-Ацвпроводят 50%-ным раствоом полиэтиленглиголя мол.массой 000, содержащего 5% .диметилсульфоксиа, в течение 1,5 мин. После гибридиации и отмывки клеток от полиэтиленликоля клетки высевают в 96-луночные цанели по 1 х 10 спленоцитов в лунку. ля культивирования и селекции гибидом используют среду 1 ЬЩМ (моцифицированная 1 з 1 оуе Б среда Дульбекко) 30 добавлением 10%ной эмбриональной те.лячьей сыворотки, 10 М гипоксантина, 4 х 10 М аминоптерина и 1,6 х 10 М тимидина. Гибриды-продуценты клониру 1 от 2 раза методом конечных разведений 35 ысевая по 1 клетке в лунку, содеращую 4 х 10 клеток селезенки. Послеклонирований практически 100% сублонов продуцируют мон АТ к Р ФНО-с. продукция антитела сохраняется как 40 минимум в течение 15 пассажей в культуре.Гибридома получила условное название 13010, штамм депонирован под номеромВСКК(П) 1730. . 45Культуральные признаки.Стандартные условия культивирования, Среда ТЮМ с 10% донорской телячьей сыворотки, 2 х 10 4 М глутамина,100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05 х 10 М меркаптоэтанола, 37 С, атмосфера 5%-ного СО 2 .Для выращивания штамма используют стеклянную посуду, посевная доза 100200 тыс.клеток/мл, клетки пассируют один раз в 2-3 дня, кратность рассева 1;6- 1:8, культура суспензионная.Культивирование в организме животных. Для выращивания асцита пригодны 1 4мыши БАЕВ/С. Мышам за 7-30 дней до инъекции клеток штамма вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана. Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 2-5 х 10клеток/мл среды 1 МОМ. Асцит формируется через 12-14 дней.Продуктивность штамма.Секреция моноклонального антитела на 2-3-й день культивирования составляет 14-20 мкг/мл культуральной среды и 5-7 мг/мл. асцитной жидкости при определении иммуноферментным методом.Характеристика полученного продукта. Штамм продуцирует моноклональное антитело 1 яС 1. Специфичность - НФО Методы оценки сохранения специфичности: тест на связывание мон АТ с иммобилизированным ФНО-Ы (иммуноферментный анализ).Антиген сорбируют на пласТине: 500 нг в 50 мкл 0,1 М бикарбонатного буфера, рН 9,б, в течение ночи при 4 С. После отмывки наносят, тестируемую культуральную среду, после инкубации и отмывки определяют количество сорбированных антител меченными пероксидазой кроличьими антимышиными анти- телами. Все отмывки проводят бидистилированной водой. Контролем служит бычий сывороточный альбумин (БСА) в качестве антигена,Криоконсервирование. Для длительного хранения клетки штамма замораживаат в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режим замораживания: 1 С/мин до -70 С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание на водяоной бане при 37 С. Жизнеспособность клеток после размораживания 55-60% по окрашиванию трипановым синим.Контаминация, Бактерии и грибы в культуре. не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и по характеру включения тимидиновой метки.П р и м е р 1, Тест на определение специфичности взаимодействия мои АТ с антигенами, иммобилизованными на пластине Р ФНО-с, Р ФНО- и БСА. в количестве 0,5 мкг в 50 мйл 0,1 М карбонатного буфера рН 9,6 вносят в лунки 96-ячеечных микроплат и сорбируют в течение ночи при 4 С. После отмывок в ячейки вносят по 50 мкл1507791 Кроличья антисыворотка1:5000А 492 х 10 Культуральная средаштамма13010А 492 х 10 Антигены 291 115 БСАФНО-Ы 2584 481 154 ФНО-Д 40 Таблица 2 Факторнекроза До сорбцииА 540 х 10 Сорбция монАТ штамма13010А 540 х 10 опухолеи Рекомбинантный ФНО- с 445 1308 316 413 Рекомбинантный ФНО-р свидетельстзывании био- комбинантно 3010. Таким ЗР 10 можетммуносорбции культуральной среды штамма 13010 или разведенных 1;5000 в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,4, 0,15 М ЫаС 1, 1 7 БСА (ЗРФ-БСА) поликлональных кроличьих антител, специфичных к Р ФНО-а. Панель инкубируют 2 ч при 20 С, затем отмывают 5 раз бидистиллированной водой и вносят по 50 мкл/лунку кроличьи противомышиные антитела, меченные 10 пероксидазой, разведенные 1:2500 в ЗФР-БСА, и меченные пероксидазой противокроличьи антитела 1:2500 в ЗФР-БСА. После инкубации в течение 1 ч прио20 С плату отмывают и в лунки добавля.15 ют субстрат - ортофенилендиамин гидрохлорид 0,6 мкг/мл в цитратно-фосфатном буфере, рН 4,7, содержащем0,033 Н О,. Реакцию останавливают через 10 мин 1 М серной кислотой и учи тывают на спектрофотометре с верти.кальным лучом при длине волны 492 нм.Результаты опыта по изучению специфичности связывания мон АТ, продуцируемого клетками штамма 13010, с антигенами, иммобилизованными на плас, тине, представлены в табл.1.Таблица 1 Результаты свидетельствуют о высокой специфичности мон АТ, вырабатываемого клетками штамма 13 Р 10, и пока" зывают возможность применения этого мон АТ для определения Р ФНО-с с помощью иммуно-ферментного метода. Высо" кая константа аффинности мон АТ штамма 13 ИО создает дополнительные преимущества при использовании в иммуноферментном анализе.П р и м е р 2, Сорбция Р ФНО-мон АТ штамма 13 П 10. К 1 мл Бра-сеФарозы 4 В добавляют 1 мл кроличьей антисыворотки к иммуноглобулинам мыши и 55 инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Несвязавшиеся антитела отмывают 0,05 М трис-НС 1,0,15 М ХаС 1, рН 74 (ТБР), путем многократного центрифугирования. С 0,3 мл полученного сорбента смешивают 5 мг сульфатной фрак(ции асцита гибридомы 13 Р 10, инкубируютна горизонтальной качалке 1 ч прикомнатной температуре, заполняют гелем микроколонку из пастеровскойпипетки и промывают ее ТБР. ОбразцыР ФНО-о( и Р ФНО-р готовят на минимальной среде, модифицированной Дульбекко (ЖМЕМ) с 57 ЭТС, глютамином,меркаптоэталоном, пенициллином и стрептомицином (полная среда (ЖМЕМ). 0,5 млобразца пропускают через коЛонку в течение 15 мин, затем собирают и стерилизуют фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.Биологическую активность факторовопределяют по лизису клеток мышинойфибробластоидной линии Ь 929 в присутствии актиномицина. Накануне, тестаклетки Ь 929 рассеивают по 50 тыс/лунку в плоскодонные 96-ячеечные микроплаты в полной среде ЖМЕМ. ОБразцыФНО раститровывают в отдельном планшете в объеме 100 мкл, затем переносят в плату с клетками Ь 929, добавляют актиномицин до концентрации 1мкг/мл и помещают в термостат с температурой 37 С на 16-20 ч. Результаты учитывают после окрашивания клеток0,27.-ным раствором генцианвиолета в27-ном метаноле в течение 10-12 мин.Оптическую плотность лунок измеряютпри длине волны 540 нм на спектрофотометре с вертикальным лучОм,Результаты опыта по сорбции Р ФНО-в(мон АТ штамма 13010 представлены втабл, 2. Данные этого примервуют о специфическом слогической активностиго ФНО-Ы мон АТ штаммаобразом, мон АТ штаммабыть использовано для1507791 Оптическая плотность окрашенныхинтактных клеток составляет 1290. Составитель А,МаныкинТехред М,Моргентал Корректор О.Пипле Редактор Л.Пчолинская Тираж 501 Подписное Заказ 551 б/29 ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 с цель изучения биологических эффектов Р ФНО-Ы, а также для его очистки е Формула изобретенияШтамм гибридных культивируемых клеток животных Мцв Мцвсц 1 цв ВСКК (П ) У 1730 - продуцент моноклонального антитела к фактору некроза опухолей-альфа человека.