Консорциум штаммов бактерий рsеndомоnаs sp. и метнylовасillus метнаnоlоvоrus, разлагающий метилацетат — SU 1687608 (original) (raw)
(5)5 С 12 И 1/20, С 12 5 ОСУДАРСТВЕННЪЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ РИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АВТОРСКО ИДЕТЕЛ ЬСТВУ ноло- штамбыть истке одстонсорциум разлагаютом, что в тд исполь штамма фабактерий ющих каруоЬас 111 цз облигатно Метила це кислоты) - ле тический полл при нормаль научно-техни ний омикробн ния. тат (метиловый эфир уксусной учий высокотоксичный синтеютант, химически устойчивый ых условиях. В патентной и еской литературе нет свереой деградации этого соединею разлаукты его(71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР и Институт микро;биологии и вирусологии АН КазССР(54) КОНСОРЦИУМ ШТАММОВ БАКТЕРИЙРЗЕОООМОИАЯ ЯР. И МЕТНУ ОВАС 103МЕТНАИО ОчОВ 1.5, РАЗЛАГАЮЩИЙ МЕТИЛАЦЕТАТ(57) Изобретение относится к биотех ологии и касается нового консорциума штаммов бактерий, который может быть использован при биологической очистке сточИзобретение относится к биоте гии и касается нового консорциума мов бактерий, который может использован при биологический оч сточных вод ацетальдегидного произных вод ацетальдегидного производства. Цель изобретения - консорциум штаммов бактерий, полностью разлагающий метилацетат. Консорциум бактерий полностью разлагает метилацетат, используя продукты его гидролиза - метанол и ацетат - в качестве источников углерода и энергии, при концентрации до 5 г/л в течение 15 - 36 ч. В качестве деструктора метилацетата используют штамм факультативно-метилотрофных бактерий Рзецбовопаз зр. ВКМ ВД, обладающий карбоксилэстеразой, совместно со штаммом МетЬуоЬас 1 цз вейапо 1 очогцз ВКМ ВД, облигатно использующим метанол. Штамм Рзецбовопаз зр, выделен из сточных вод ацетальдегидного производства в Казахской ССР, Штамм Мейу 1 оЬасцз вейапо 1 очогцз выделен из активной коры очистных сооружений целлюлозно-бумажного комбината Эстонской ССР, Консорциум используют при соотношении штаммов 2:1; 1 табл. Цель изобретения - новый к штаммов бактерий, полностью щий метилацетат,Изобретение заключается в качестве деструктора метилацет зуют консорциум, состоящий из культати вно-метилотрофных Рзецбовопаз зр. 24 ВА, облада боксилэстеразой, и штамма МетЬ вейапоочогцз ВКМ ВД, использующего метанол.Консорциум бактерий полнос гает метилацетат, используя прки,гидролиза (метанол и ацета 1) в качестве источников углерода и энергии,Штамм Рвецбоглогэаэ вр, 24 ЯА выделениэ с 1 очных вод ацетальдегидного производства в Казахской ССР,Штамм имеет следующие карактеристиМорфолого-культуральн ые признаки, Клетки - бесцветные подвижные палочки 0,50,7 х 1,3-1,7 мкм с одним полярным жгутиком, грамотрицательные, неспорообраэующие, не имеющие сложных внутрицитоплазматических мембран, подобных метанотрофным бактериям. Не имеют простек, Размножаются делением пополам, образуют полярно расположенные пили.Колонии на МПА до 5 мм в диаметре, округлые, непрозрачные, с ровным краем, белые, поверхность гладкая, профиль выпуклый, структура однородная, консистенция вязкая.Физиолого-биохимические признаки.Азроб, растет при 10 - 39 С, оптимум.28 - 32 С. Оптимум рН 6,8-7,2, при рН 3,6 не растет.Флюоресцирующие пигменты, пиоционин, каротиноиды не образует. Имеет оксидазу, каталазу, аргининдигидролазу, Нитраты восстанавливает в нитриты. Леван из сахарозы, ацетоин, индол, ацетилметилкарбинол не образует. )Келатин, целлюлозу, поли- Д -оксибутират не разлагает, но гидролиэует крахмал и твин, Поли--оксибутират внутриклеточно не накапливает. ОЕ- /3 -оксибутират не использует в качестве источника углерода в недостаточной по азоту среде.Источниками углерода для роста служат формиат, метанол или этанол при низких концентрациях (0,05-0,1%), метилацетат, этилацетат, этилформиат, бутилацетат, изопропанол, иэобутанол, а-арабиноза, фруктоза. а -рамноза, О-рибоза, О-ксилоза, глюкоза, сахароза, О-серин, ацетат, бетаин, саркозин, глицин, фумарат, сукцинат а-кетоглютарат.Среду с глюкозой подкисляет, газообразование отсутствует. Глюкозу анаэробно не ферментирует. Рост не обеспечивают формальдегид,метиламин, триметиламин, этиламин, трегалоэа, 3 -аланин, -серин, фенилаланин, ОЕ-аргинин, глиоксилат, и-оксибенэоат, М-оксибензоат,мезоинозит.Не растет автотрофно в атмосфере СО 2 + Н 2 + 02. В качестве источников азота использует соли аммония, нитраты и некоторые аминокислоты. В ростовых факторах не нуждается. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ПЦ моль " ДНК (1) 61 Л,Ш 1 амм МейуоЬабИцв лэейлпоочогцэ ВМК БД выделен из активной коры очистных сооруже н ий целя юлоз но-бумажного комбината Эстонской ССР и имеет следующие характеристики. Морфолого-культуральные признаки.Бесцветные подвижные палочки 0,5 х х 2 мкм с одним полярным жгутиком, грамотрицательные. Спор и капсул не образуют, не имеют сложных внутрицитоплазматических мембранных структур, размножаются делением пополам.Колонии на минеральной агаризованной среде с метанолом в качестве источника углерода и энергии - округлые, выпуклые, бесцветные, гладкие, до 1 мм в диаметре, край ровный. структура однородная, консистенция вязкая.Физиолого-биохимические признаки.Облигатный аэроб, оптимальная температура для роста 35 С, оптимум рН 6,8 - 7,4, Облигатный метилотроф, использует метанол в качестве источника углерода и энергии, не способен к росту на средах с полиуглеродными и другими одноуглеродными субстратами. Источниками азота служат соли аммония или нитраты. В дополнительных факторах роста не нуждается.В присутствии 0,50 -ного метанола в среде гидролизует крахмал, клетчатку не разрушает, сероводород, индол, ацетоин не образует, желатину не разжижает. Катало-, уреаэо-, оксидазоположителен, Нитраты восстанавливает до нитритов, Использует метанол через 2-кето-дезокси-фосфоглюконатный вариант рибулоэомонофосфатного цикла фиксации формальдегида.Гц моль 0 ДНК (Тпп) - 52,2.Тип взаимодействия между штаммами в консорциуме при использовании метилацетата симбиотический, Штамм Рзецбогпопаз зр. ВКМ ВД обладает карбоксилэстеразой, катализирующей гидролиз эфирной связи метилацетата с образованием метанола и ацетата. Ацетат ассимилируется этим штаммом через цикл трикарбоновых кислот и глиоксилатный шунт (изоцитратлиаэу и мал атси нтаэу). М етанол асс имил ируется Рзецбопэопаз эр. ВКМ ВД через сериновый путь Сэ-метаболизма, однако использование метанола лимитируется низкой активностью алкогольоксидаэы, Метанолдегидрогенеза (ФМС, НАД) у данного штамма отсутствует, В результате культура Рэецбоэтэопаэ эр, ВКМ В 1735 Д при росте на среде с высокой концентрацией метилацетата (более 2 г/л) активно потребляет один из продуктов его деградации - ацетат, а метанол постепенно накапливается в средеи начинает ингибировать дальнейшее расщепление метилацетата.Мейу 1 оЬас 11 цз гпейапоочогцз ВКМ В 1447 Д - облигэтный метилотроф, обладающий метанолдегидрогеназой (ФМС) иактивно ассимилирующий метанол.МейуоЬас 1 цз гпейапо 1 очогцз ВКМ В 1447 Д не ингибируется метилацетатом, ноне имеет карбоксилэстеразы и не может использовать метилацетат в качестве источника углерода и энергии.При совместном культивированииРзецбощопаз зр. ВКМ ВД иМ,тейапоочогцз ВКМ ВД достигается полная утилизация метилацетата. 1Получение консорциума,Консорциум может быть составлен изсуспензии клеток Рзецбогпопаз зр. ВКМ В 1735 Д, выращенной на среде "Д" с 2 г/лметилацетата, и суспензии Мейу 1 оЬасИЬз 2тейапо 1 очогцз ВКМ ВД, выращеннойна среде "К" с 5 г/л метанола, в соотношении при равной плотности суспензий соответственно 2:1. При изменении этойпропорции (в пределах 0,5:1 - 4:1) в начале 2культивирования консорциума на метилацетате штаммы в процессе роста постепенно достигают оптимального соотношенияклеток (2:1). Это обусловлено тем, что ростоблигэтного метилотрофа МейуоЬас 11 цз 3пейапо 1 очогцз ВКМ ВД лимитированметанолом, образующимся при разложенииметилацетата штаммом Рзецбогпопаз зр,ВМК ВД.Состав среды "Д", г/л дистиллированной воды;(ЙН 4) Н 2 Р 04 1,0К 2 Н Р 04 1,0Иа С 5,0М 98047 Н 20 0,2Ре 304 7 Н 20 0,004Среду по 100 мл стерилизуют в колбахна 750 мл при 1 атм ЗО мин. После засева30 мл суспензии вносят 2 г/л метилацетатаи закрывают колбы резиновыми пробками 4для предотвращения испарения метилацетата.Культуру Рзецбовопаз зр. ВКМ ВДвыращивают на качалке при 180 об/мин при30 С в течение 30 ч. 50 Состав среды "К", г/л дистиллированной воды:КН 2 Р 04 2,0(МН 4)2 3042,0 5 М 93047 Н 20 0,175Ее 304 7 Н 20 0,002рН 7,2 доводят раствором йаОН. Среду стерилизуют при 1 атм 30 мин. Культуру Мет 1 уопасц:; тн 11 дпоо ч ц .ВКМ ВД выращивают в кочбдх и750 мл с 200 мл среды и 5 г/л меганплэ накачалке при 180 об/мин при 30 С в течение5 24 ч.Условия хранения консорциума и составляющих его штаммов,Консорциум сохраняют на жидкой среде "Д" при 4 С и производят пересевы через0 каждые две недели, при этом культура сохраняет высокую биохимическую активность.В лабораторных условиях культураРзецбогпопаз зр. ВКМ ВД поддержи 5 вается на косяках с МПА и пересеваетсячерез две недели, культура Мейу 1 оЬасПцзгпейапо 1 очогцз ВКМ ВД поддерживается на агаризованных (2) косяках сосредой "К" и 0,5 (об/об) метанола и переО севается один рэз в месяц,Штаммы Рзецбогпопаз. зр. ВКМ В 1735 Д и МейуоЬасИ 1 цз гпейапоочогцзВКМ ВД хранятся в лиофильно высушенном состоянии, защитная среда - моло 5 ко, при этом свойства штаммов устойчивы,П р и м е р. 30 мл суспензии 10 кл/мл,выросшей на среде с:метилацетатом двухсуточной ассоциации культур Рзецбоаопаззр. ВКМ ВД и МетЬу 1 оЬас 11 цз0 гпейапо 1 очогцз ВКМ ВД высевают вколбы со средой "Д". В качестве источникауглерода и энергии вносят 5 г/л метилацетата. Культивирование осуществляют накачалке при 180 об/мин при ЗО С. Количест 5 венный газохроматографический анализкультуральной жидкости на содержание метилацетата, метанола и ацетата проводятчерез каждые 3 ч в течение 36 ч культивирования.40 Контроль за процессом деградации метилацетата осуществляют с помощью газовой хроматографии на хроматографе "РуеОпсап 104" по убыли метилацетата и образованию метанола. Колонка (70 см, Я 2 мм)5 заполнена Порапаком О. Скорость Н 2 равна30 мл/мин, воздуха - 300 мл/мин, 1 ч 2 -ЗО мл/мин. Температура колонки 110 С,Ацетат определяют на газовом хроматографе "Хром 4". Колонка 1,8 м, Я 4 мм)заполнена Порапаком 03, Скорость Н 2 рав. на 35 мл/мин, воздуха - ЗОО мл/мин, й 2 -35 мл/мин, Температура колонки 160 С.К 15 ч культивирования разлагается65 метилацетата; метанол и ацетат в среде5 отсутствуют, К 36 ч метилацетат и продуктыего деградации (ацетат и метанол) в средене обнаруживаются.Экспериментальные данные представлены в таблице.В м Составитель И. БолотинаРедактор М, Петрова Техред М.Моргентал КоРРектоР В, Гирня Заказ 3678 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская нэб., 4/5 одственно-издательский комбиНат "Гатент", г, Ужгород, ул,Гагарина,Как следует из данных таблицы, полученный консорциум микроорганизмов полностью разлагает метилацетат, Один из штаммов консорциума (Рзецдовопаз зр. ВКМ ВД) способен полностью разла гать метилацетат при низких его концентрациях (0,1 - 0,5 г/л), При. более высоком содержании метилацетата в среде его деградация и рост штамма тормозятся накапливающимся токсичным метанолом. 10Таким образом, консорциум бактерий Рзецдогпопаз зр, ВКМ ВД и МетЬуоЬасИцз тейапоочогцз ВКМ В 1447 Д обладает способностью полностью разлагать метилацетат при его концентрации до 5 г/л в течение 15 - 36 ч, что обеспечивает возможность его использования при очистке промышленных сточных вод ацетальдегидного производства.Фо рмула изобретения Консорциум штаммов бактерий Рзецбогпопаз зр. ВКМ ВД и Метйу 1 оЬас 1 цз гпейапоочогцз ВКМ В 1447 Д, разлагающий метилацетат,