Питательная среда для выращивания бактерий francisella тulаrеnsis — SU 1703683 (original) (raw)

(1 РИ Гл 11 Т ССС 1 ЕТЕН ина с ис ма 02 М а 08 г) в ус пензию мешалке рилизуют юлозные поненто основно 1 осУ,1 АРСТГ 1 Е 1111 Ой к 1 Чи1Г 10 ИЗОТlЕ 1 Г 1 ИЯ 1 Ч И О 1 КР. ТИЯМ ОПИСАНИ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ 121) 4800478/13(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (72) П В.Бабаева, В Г.Гавриков. Л.И.Абросимова и И.В Шолохов(56) Авторское свидетельство СССР Мт 1013470, С 12 М 1/20 1981.Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 1969. М 4. с. 34 - 36. (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ БАКТЕРИЙ РВАМСБЕА Т О ЕА В Е Р 1 515(57) Изобретение относится к микробиологии. а именно к получению питательных сред. Целью изобретения является повышение ростовых свойств. Поставленная цель Изобретение относится к микробиологии, а именно к получению питательных сред,Цель изобретения повышение ростовых своиств.П р и м е р 1 Питательную сре, поэтапно следующим образамПриготовление колчплекса ем тидином,24 мг гемина добавляют к 20 раствора солянокислого гистидин дистиллированной воде(рН 8 О) С оставляют в темноте на магнитно при 21 С на 15 ч. после чего сте фильтрацией через нитроцелл фильтры диаметром пор 0 22 мкм.Приготовление растворов ком питательной среды вносимых в раствор отдельно достигается тем. что в среду, содер: сащую 1-аргинин-НС 1. -цистеин-НС 1, 1.-гистидинНС 1. 1-лизин-НС 1. 01.-изолейцин 01-ме.ионин, 01-треонин, 1-пролин. -лейцин.1-валин, -тирозин, -серин. -аспарагиновую кислоту, калий фосфорнокислый, Одно замещенный. натрий фосфорнокислый двухзамещенный, сернокислый магний семиводный. глюкозу, агар-агар и воду, дополнительно вводят комплекс гемина с гистидином и дрожжевой экстракт. Полученна среда позволяет выращивать единичные. колонии как вакцинных, так и вирулентных штаммов. Стабильность состава и высокая химическая чистота компонентов. используемых для ее приготовления, делает возможным применение этой среды в технологии производства туляремийной вакцины. 2 табл. Раствор дрожжевого экстрактаК 15 г дрожжевого экстракта осторо:кно добавляют 70 мл дистиллированной воды и добиваются полного растворения при гостоянном перелчешивании. после чего дс 1 водят объем до 100 мл дистиллированной водой.Раствор глюкозы.К 100 мл теплой дистиллированной воды присыпают 50 г глюкозы и перемеш 11 вают до полного растворения.Приготовление основных растворов для получения плотной синтетической питательной среды.Приготовление К-Ма-фосфатного буфера.На 1 л берут 1.5 г двузалчещенного фосфорнокислого натрия (МаЗНРОч) и 2.6 г однозамещенного фосфорнокислого калия (К" НРО,") растворяют отдельно в 300 лчл ди 170368320 стиллированной воды и, нагревая растворыдо 70 С, добиваются полного растворениясолей, после чего растворы сливают, охлаждают до комнатной температуры, доводятрН до 7,2-7,3 и добавляют дистиллированную воду до 1 л,Для получения плотной синтетическойсреды разделяют К-Ма-фосфатный буфер надве части по 500 мл и к одной из них добавляют 10 г агар-агара (раствор А). 10Оставшуюся часть К-Ма-фосфатного буфера используют для растворения аминокислот и солей, получая раствор Б.Готовят следующие навески, г:-аргинин-НС 0,15 15-гистидин-НС 1,8-цистеин-НС 1,3-лизин-НС 0,35ОЛ.-изолейцин 0,2О, А-метион и н 0,45О, -треонин 2,0.-серин 0,1-аспарагиновая кислота 0,1йаС 4,5М 9504 7 Н 20 0,04Каждую из аминокислот растворяют последовательно в 20 мл буфера. нагревают до90 С, перемешивая до полного растворения. Для лучшего растворения к растворамлейцина, изолейцина и цистеина добавляютпо 1 мл 1 М раствора НС, а к растворам 35теронина и тирозина по 1 мл 1 М растворайаОН.Навески хлористого натрия и сернокислого магния растворяют вместе в 50 мл КМа-фосфатного буфера. Полученные 40растворы аминокислот и солей сливают водну емкость, доводят объем остатками Кча-фосфатного буфера до 0.5 л (раствор Б) истерилизуют в автоклаве с отдельно приготовленными растворами дрожжевого экстракта и глюкозы 20 мин при 110 С идавлении 0,5 атм,Раствор А расплавляют на кипящей водяной бане (100 С) в течение 20 мин,После стерилизации и охлаждения к 50раствору Б асептически добавляют 5 мл комплекса гемина с гистидином; 30 мл 15%-ного раствора дрожжевого экстракта; 28 мл50-ного раствора глюкозы,В случае необходимости стерильно доводят рН полученной среды до 7,0-7,2, используя 0,1 М растворы НС или МаОН.Осторожно вливают подогретый до 45 Сраствор Б с внесенными добавками в емкость с расплавленным агаром (раствор А) и разливают полученную плотную среду вчашки Петри по 25-30 мл.Разлитые чашки со средой, а также комплекс гемина с гистидином, растворы дрожжевого экстракта и глюкозы можно хранитьпри 4 С д 60 сут (время испытания).Хранение растворов А и Б возможно, нов этом случае необходимо внесение свежеприготовленного раствора цистеина в раствор Б. Для этих целей исключаютНС-цистеин из состава заренее приготовляемого раствора Б и готовят 10-ный раствор солянокислого цистеина, стерилизуяего автоклавированием при 110 С и давлении 0,5 атм в течение 20 мин, Обычно берут5 г солянокислого цистеина и растворяютего в 50 мл дистиллированной воды. Из стерильного 100 -ного раствора цистеина вносят асептически в стерильный раствор Б13-17 мл непосредственно перед разливомсреды,П р и м е р 2. Готовят питательную средуаналогично описанию в примере 1, используя при этом следующие навески компонентов, г;К-Ма-фосфатный буферКН 2 РО 4 3,1Ма 2 НРО 4 1,8Раствор А:Агар-агар 15,0раствор Б.-аспарагиновая кислота 0,3МаС 5,5М 9304 7 Н 20 0,05К проавтоклавированному раствору Бстерильно добавляют 20 мл комплекса гемина с гистидином; 5 мл 157 О-ного растворадрожжевого экстракта; 32 мл 50 о -ного раствора глюкозы,П р и м е р 3. Микробиологические испытания плотной питательной среды, описанной в примерах 1 и 2, проводились сиспользованием в качестве тест-штаммовжглоагепвв вакцинного штамма 15/3 (Гайского) и вирулентного штамма голарктической разновидности ч. 503. Контрольнымисредами сравнения служили среда Майского и соавта также среда Кундина наоснове агара "Д" со щелочным раствором "черного альбумина", как одна из наиболее чувствительных питательных сред, известных в настоящее время.Испытания включают определение: а) чувствительности (способности среды обеспечивать рост микроба иэ минимальных посевных доз); б) скорости роста (времени появления типичных колоний); в) показателей прорастания (процентное отношение числа сформировавшихся колоний на испытуемой среде к числу таковых на контроле).Для подготовки испытаний штаммы, хранившиеся в лиофилизированном состоянии, дважды пересевались на среду МакКоя и инкубировались при 37 С в течение 48 ч, Взвесь микробных клеток готовят, используя стандарт мутности на 10 ед, ГИСК им, Л,А.Тарасевича, последовательными 10- кратными разведениями до 500 и 50 клеток в 1 мл, Каждую посевную дозу высевают по 0,1 мл на 5 агаровых пластин с вариантами сред примеров 1 и 2, а также с контрольными средами, Инкубируют при 37 С в течение 3 сут.Результаты исследований приведены в табл. 1 и 2.Полученные данные свидетельствуют о том, что в отличие от среды Майского на предложенной среде удалось добиться удовлетворительного роста вакцинного и вирулентного штаммов Рглц 1 агепвв, сходного по количественным показателям со средой Кундина, Колонии штамма 15/3 появлялись на разработанной среде уже через 48 ч культи 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 вирования и достигали максимальных размеров через 72 ч, в то время как колонии штамма 503 появлялись несколько позднее (через 72 ч) и достигали максимальных раэмеррв через 96 ч, Изолированная колония достигает 1,0-2,5 мм в диаметре, по форме округлая, выпуклая, прозрачная с серовато- голубоватым оттенком.Таким образом, предлагаемая плотная питательная среда может найти широкое применение для подсчета жизнеспособных клеток, при выделении чистых культур, определении питательных потребностей как известных ранее, так и вновь выделяемых штаммов туляремийного микроба Стабиль ность состава и высокая химическая чистота компонентов, используемых для ее приготовления, делает возможным применение этой среды в технологии производства туляремийной вакцины,5 - 20 млДо 1 л Формула изобретения Питательная среда для выращивания бактерий Ггапс 1 веПа ти 1 агепз 1 з, содержащая солянокислый З.-аргинин, солянокислый 3 -цистеин, солянокислый 3 -гистидин, солянокислый 3-лизин, 0,3-иэолейцин, О,- метионин, О,3 -треонин, 3.-пролин, 3 -лейцин, 3 -валин, -тирозин, 3:серин, 3:аспарагиновую кислоту, калий фосфорнокислый одно- замещенный, натрий фосфорнокислый двухзамещенный, натрий хлористый, магний сернокислый семиводный, глюкозу, агар-агар и дистиллированную воду, о т л ич а ю щ а я с я тем, что, с целью повышения ростовых свойств, она дополнительно содержит комплекс гемина с гистидином и дрожжевой экстракт при следующем количественном соотношении компонентов, г/л;Солянокислый -аргинин 0,15-0.25 Солянокислый 3 -гистидин 1,2-1,8 Солянокислый -цистеин 1,3-1,7 Солянокислый 3:лизин 0,35-0,45 О,3 -изолейцин 0,2-0,4 0,1-метионин 0,45 - 0,550,3 -треонин 2,0-4,03:п родин 0.9-1,1 3:лейцин 0,2-0,4 1-валин 0,75 - 0,85З.-тирозин 0,15-0,253-серин 0,1 - 0,3 -аспарагиновую кислоту 0,1-0,3 Калий фосфорнокислыйоднозамещенный 2,6-3,1 Натрий фосфорнокислыйдвухзамещенный 1,5-1,8 Натрий хлористый 4,5-5,5 Магний сернокислыйсемиводный 0,04-0.05 Глюкоза 14,0-16,0 Дрожжевой экстракт 0,75-3,0 Агар-агар 10,00 - 15,00 Комплекс гемина с гистидиномДистиллированная вода1703683 Таблица 1 Среда Кундина спл,рост 38+7 4+0,2 спл.рост 46+4 4+0,6 Таблица 2Сравнительные данные показателей прорастания и темпов роста питательных сред ер колоний,503 72+0,5-1 4+ Составитель А. ФедоТехред М.Моргентал Волко Корректор Т. Мале дак Подписноео изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР35 Раушская наб., 4/5 аказ 40 Тираж ВНИИПИ Государственного комитет 113035, Москва, нно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 10 оизв Биологические свойства питательных сред для культивирования туляремийного микроба

Смотреть

Питательная среда для выращивания бактерий francisella тulаrеnsis