Рекомбинантная плазмидная днк frblv f6, кодирующая слитый белок оболочки бактериофага и белок оболочки 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота, способ ее конструирования и штамм бактерий еsснеriснiа coli прод (original) (raw)
(51)5 ОБРЕТ микробиолоной и белконие полипепочки бактеридр 51 вируса та. антный ген 1 г.нтез соответрРРВ Ьз 6тамма-продуГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИ К АВТОРСКОМУ СВИ(71) Институт органического синтеза А Н Лате. СССР (ВЩ, Отдел медицины (Верите Уннеереитета Гумбольдта (Берлин) ЦМф . (72) РВВЙф. Улцмх, Хельга Сиаккбу, ВЩве.лил ГЬатцер, Зинаида Розенталь; Хаме Ал- . фред. Розенталь (ОО), Т.М,Кеэаевекаа, И,В.Семеаская, Д.З.Дрвйлина, О.А.барже Й,МЛущко. ЙЛ 1.Пумпен и Э,Я.Грен (ЗЩ .(86) Мацек АЯ авб Кеп Я,В,И. и обвюеее Ьчщв емагсЬ, 1988, м 34, р, 65.Козловская Т,М. и др. Докл. Ан СССР, 1986, 287, стр, 482.йуакаЬга Е. е а Еоа Ыоодс 1966, ю 31 с, 116.(54) РЕКО 4 ЬИНАНТНАЯ ПЛАЭМИДИАЯ ДНК рРЙВО/эР 6, КОДИРУЮЩАЯ СЛИТЫЙ БЕЛОК ОБОЛОЧКИ БАКТЕРИОФАГА й И БЕЛОК ОБОЛОЧКИ 6 Р 51 ВИРУСА ЛЕЙКО.ЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ И ШТАММ БАКТЕРИИ ЕЗСНЕВ 1 СН 1 А СОО-ПРОДУЦЕЙТь . Изобретение относится к гической промышленности ге вой инженерии, биотехнологи Цель изобретения - получ тида с активностью белка обод офага 1 г и белка оболочки лейкоза крупного рогатого ско Сконструирован рекомбин СР-В:Ч 51 ЗЬ, кодирующий си ствующего белка и плазмиды для его экспрессии, а также ш цента, Е,со 1 (рРВВ 1 ЧЗР 6), СЛИТОГО БЕЛКА 06 ОЛОЧКИ БАКТЕРИОФАГА Рй И БЕЛОК ОБОЛОЧКИ 6 Р 51 ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУЙНОГО РОГАТОГО СКОТА(57) Изобретение относится к микробиологической промывлве 1 Мю, эВнмей и белковой инженерию, 6 ФФЮпФФМФВВ, Цель 1 о изобретения явлветеа ФЖеуееймЕ Еяитного белка оболочки Ь и Ввацу 3 айреса лейкеэа крупного югамВВ Фаз М ФФздание штамма Ез ЬегИйа МЦ. НФЦЮЦЮФ йаазмиду рГНВ ЧзР 6, кодйруащуф аинтаэ укаэанного белка. ИэобрвтанеВ МЖВЮчаеме Еебв конструированме елазмедм фИВ.ЧЗЕб, заключающееся е ввадаимм виремента 8911-.Есо 781 ДИК аваааы ХФЩ 3 в плаз- Б ми рЩ го. Ун жаеьнаМаайть 1 РВстрикции: у) ВврМ 11, рЫ, Зса 1, ЙраК МЬИ, Зас 1. Ача.Продуктивность атеаФцмфваго яра-;1 ( дукта от общегоклеэвМиеебелка. йлаэмида аводтся трансформацэей а ажтв Е.со 1 к Б 8 О 2 с последующим етбцам щтамма-продуцента рекомбинаитйаа бааа ,сей ВКПМ 8-4983. 3 с,п,ф-лы, 1 табл. а4 Рекомбинантная плаэмида рГЯВ ЧЗ 1.6 состоит из следующих элементов:ДНК плазмиды рРР 20; которая несет полный ген БО г и имеет делецию в гене тетра ци клин - устойчивости,ВдЬ 1 - Есо 781 фрагмента ДНК А НЧ 1, кодирующего участок пос 11 едовательности др 51 (9 аминокислот), соответствующий 56- 64 аминокислотам зрелого др 51 и содержащего иммунологический зпитоп-сайт узнавания моноклональных антител вАК 14,В состав ДНК рекомбинантной плазмиды рЕРВЕЧЗР 6 входят гены:10 20 30 40 45 ген 1 г СР-ВЧ.51 зК обеспечивающийсинтез рекомбинантного белка;ген о 1 а, обеспечивающий устойчивостьк ампициллину.Ген 1 г СР-В.Ч 51 з 1 находится под контролем промотора Ртгр.Плазмида рРВВ ЧЗР 6 амплифицируется при добавлении в среду хлорамфеникола,нвконьюгативна.Сущность способа конструированияплазмиды рРВВ ЧзГ 6 состоит в том, чтофрагмент гена др 51 вируса лейкоза, соответствующий нейтрализующему эпитопу сприлежащими аминокислотами (аминокислоты 65-103), выщепляется из плазмидырРВВ ЧзР 6 содержащей 56-103 аминокислоты ср 51, с сохранением 56-64 аминокислот ц р 51, соответствующих сайту узнаваниямоноклональных антител вАК 14, и образованием рекомбинантного гена СР-В 51.Штамм-продуцент 1 г СР - В Ч 51 зЬ получают трансформацией клеток Е=соИ К 802рекомбинантной плазмидной ДНКрРЯВ 1 зР 6,Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, граммотрицательные.Культуральные признаки. Клетки растутна обычно используемых питательных средах, образуют колонии средней величины,Физико-биохимические признаки, Оптимальная температура культивирования37 С,оп гимумрН 7,0 - 7,4. В качестве источника углерода," используют углеводы, в качестве источника азота - минеральныесоли, а также органические соединения ввиде пептона" ,триптона, аминокислот.Устойчивость к антибиотикам, Устойчивк ампициллину, что обусловлено наличиемплаэмиды, Присутствие в штамме плазмидной ДНК подтверждается путем проверкиустойчивости к ампициллину.. Штамм депонирован в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В.П р и м е р 1, Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК рГРВ Чз - Р 6,20 мкг ДНК плаэмиды, содержащей ВцВааН 1 фрагмент ор 51 и выделенной стандартным методом. расщепляют 50 ед,рестриктазы Вцб и 50 ед, рестриктазыВааН 1 в 100 мкл раствора А, содержащего100 мМ трис-НС, рН 7,5; 50 мМ КаСи10 мМ МОСЕ, в течение 2 ч при 37 С, Рестриктаэы инактивируют 15 мин прогреванием при 65 С, После очистки ДНКВцб-ВавН 1 фрагмента на агарозном гелеизвестным методом ДНК растворяют в20 мкл Н 20, Заполнение концов проводят в100 мкл раствора Ь, содержащего 50 мМтрис НС, рН 7,5: 10 еМ МцСЬ, 10 мМ дитиотрейтол, 25 М чаСЙ 100 мМ. бАТР, бСТР,ОТТР и ббТР и 10 ед. ДНК-полимеразыЕ,соИ (фрагмент Кленова), в течение 1 ч при12 С, После переосаждения этанолом ДНКрастворяют в 10 мкл Н 20 (ДН К 1),2 мкг плаэмиды рЕР 20 расщепляют 3ед.рестриктазы ЕсоВЧ в 25 мкл раствора В,содержащего 10 мМ трис-НС, рН 7,5; 50 мМйаС и 10 М МоСг, в течение 1 ч при 37 С,наносят инкубационную смесь на 1,50-ныйагарозный гель, фрагмент, соответствующий линеаризованной плазмиде рРР 20, выделяют из агарозного геля (ДНК.2).0,1 мкгДНК 1 и 0,1 мкгДНК 2 зашиваютТ 4 ДНК-лигазой в 10 мкл раствора Г, содержащего 50 мМ трис-НС, рН 7,5; 10 мММдС 2, 10 мМ дитиотрейтол, 50 Ы АТР и 10ед, Т 4 ДНК-лигазы, в течение 12 ч при 4 С,Фрагмент инактивируют нагреванием при650 С в течение 15 мин, К реакционной смесидобавляют 100 мкл клеток Е,соИ ВВ 1, обработанных 100 мМ СаС 2 (конечная концентрация - 5 х 10 клеток/мл), длятрансформации клеток,Отбор клонов осуществляют путем экспресс - выделения ДНК и ее рестрикционного анализа, а также секвенирования.Плазмида с ожидаемой последовательностью получает наименование рГРВ Ч-Р 6,Конструирование рекомбинантнойплазмидной ДНК рЕРВ ЧзР 6,2 мкг плазмиды рРРВ Ч-Г 6, выделенной стандартным методом, расщепляют 3.ед, растриктазы Есо 781 и 3 ед, рестриктазыЗзр 1 в 25 мкл раствора А, содержащего100 мМ трис-НС, рН 7,5; 50 мМ йаС и10 мМ М 9 О, в течение 1 ч при 37 С. Рестриктазы инактивируют 15 мин. прогреванием при 650 С., Заполнение липких концовпроводят в 200 мкл раствора Б, содержащего 50 М трис-НС, рН 7,5; 10 мМ МяС 2,10 мМ дитиотрейтол, 25 мМ йаС, 100 мМдАТР, бСТР, дТТР и ббТР и 5 ед, ДНК-полимеразы Е.соИ (фрагмент Кленова) в течение1 ч при 12 С; После очистки на агароэномгеле ДН К растворяют в 20 мкл Н 20 (ДН К 3)0,05 мкг ДНК 3 зашивают в 4 ДНК-лигазой в 20 мкл раствора Г, содержащего.50 мМ трио-НС, рН 7,5; 10 мМ МцС 2, 10 мМдитиотрейтол, 50 мМ АТР и 10 ед, Т 4 ДНКлигазы, в течение 12 ч при 4 С. Ферментинактивируют нагреванием при 65 С в течение 15 мин. К реакционной смеси добавляют100 мкл клеток Е.соИ ВВ 1, обработанных100 мМ СаС 2 (конечная концентрация -5 х 10 клеток/мл), для трансформации клеток,Отбор клонов осуществляют путем рестрикционного анализа плазмидной ДНК,выделенной экспресс-методом, и секвенирования. Плазмида с ожидаемой нуклеотид.ной последовательностью получает наименование рГРВ ЧзЕ 6.Штамм-продуцент Е,со К 802 (рЕРВ.ЧзЕ 6),Штамм-продуцент получают трансформацией клеток Е,соИ К 802 рекомбинантной плазмидой рЕРВ ЧзЕ 6. Клетки выращивают в солевой среде М 9 с добавкой, г/л: казаминовые кислоты 10, глюкоза 2,ампициллин 0,02 до оптической плотности ОПо 5 о 4-5.Определение др 51- и 1 г активности методом иммуноблотинга.Для иммуноблотинга клетки (6 мг) суспендируют в 100 мкл буфера для нанесения образцов на полиакриламидный гель по Лэммли, содержащего 2-ный додецилсульфат натрия (ДСН) и 2 -ный ф-меркавтоэтанол, и лизируют 2 мин прогреванием на кипящей водяной бане. Полученные лизаты (2-4 мг/мл белка) наносят на полиакриламидной, градиентный гель (12-18%) размером 150 х 150 х 0,75 мм. Злектрофорез проводят в течение 15 ч при силе тока 7 щ А. После электрофореза белки переносят на нитроцеллюлозу НАЯР. Фильтры инкубируют с моноклональными антир 51 антителами вАК 14 в разведений 1;500 на буфере ТВЗ, содержащем 50 мМ трис-НС, рН 7,5;0,15 М йаС; 0,1 фД тритон Х; 1 ф БСА, в течение 15 ч. при 20 ОС: После трехкратной отмывки буфером ТВЗ фильтры инкубируют 2 ч при 20 ОС с конъюгатом пероксидазы с антителами против иммуноглобулинов мыши в разведении 1:500. Фильтры отмывают буфером ТВЗ (3-5 раз) и проявляют диаминобензидином. В параллельной постановке фильтры инкубируют с анти-гСР антителами кролика в разведении 1:200 на буфере ТВЗ втечение 15 ч при 20 ОС, После двукратной отмывки буфером ТВЗ фильтры инкубируют 2 ч при 20 ОС с конъюгатом пероксидаэы с белком А З.ацгеиз. Лизаты клеток штамма - продуцента обнаруживают в обоих случаях специфические зоны окраски, соответствующие белку с молекулярной массой 14,7 КД (или длиной 140 аминокислот), что соответствует ожидаемо-. му по схеме конструирования.Определение титра .1 г СР-В Ч 51 зЬ,методом РИД.Титр определяют с помощью радиаль-. ной иммунодиффузии по Ухтерлони, Для этого готовят двукратные серийные разве 1015 203035405055 рЕРВ ЧЗЕ 6, кодирующая слитый белок оболочки бактериофага В и блок оболочки др 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота размером 5297 п.о, и мол.м. 3,39 моль,. содержащая плазмидную ДНК рЕР 20 размером 5268 п.о. и мол,м. 3,38 моль; Вд-Есо 781 - фрагмент ДНК А НЧ 1, размером 29 п.о. и мол.м. 0,01 моль, кодирующий аминокислотную последовательность белка др 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота с 56 по 64-ю аминокислоту; уникальные сайты рестрикции со следующими координатами: ВЗрМП (О - начало координат), РЗт 1 (1947),Зса 1 (2182)- Нра 1 (3640), МЗт(3885), Зас(4451), АЧа (4672); гены, генетические маркеры; регуляторные участки: ген Юг СРВ Чдр 51 ЗЬ, обеспечивающий синтез рекомбинантного белка 1 г СР-В Чдр 51 ЗЬ; ген Ьа, обеспечивающий устойчивость к ампициллину; промотор триптофанового оперона - Рггр из Е. со , под контролемкоторого находится ген 1 г СР-В Чдр 51 ЗЬнеконъютатив на.. 2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК рЕРВ ЧБЕ 6, кодирующий слитый белок оболочкибактериофига 1 г - и белок оболочки др 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота, заключающийся в том, что Вдг 1 - Ваш Н 1 фрагмент ДН К Л НЧ 1 обрабатывают ДНК -полимеразой Е.соИ и встраивают в ДНК плазмиды рЕР 20 по сайту для эндонуклеазы рестрикции ЕсоР. отбирают клоны,содержащие плазмиду рЕРВ Ч-Е 6, из которой выщепляют участок ДНК, находящийся между сайтами для рестриктаз Есо 781 и ЗЗр 11.обрабатывают ДН К-полимеразой Е.соИ и отбирают клоны, содержащие плазмидурГРВ ЧзЕ 6 и синтезирующие белок 1 гСР=В Чдр 51 ЗЬ. 3, Штамм бактерий Е,соИ ВКПМ Впродуцент рекомбинантного слитного белка оболочки бактериофага Юг и белокоболочки др 51 вируса лейкоза крупного рогатого скота,дения клеточного лизата и титруют противантиг СР антител кролика. В качестве стандарта используют очищенный 1 гСР, полученный из рекомбинантных бактерий (1 мгмл), Результаты титрования 1 гСР -В Ч 51 зЬ активности методом РИД приведены. в таблице.Формула изобретения 1, Рекомбинантная плазмидная ДНКТитр в РИД Белок, мг/мл БО Фг, мг/мл ОП 65 о Штамм 4,0 1:156 20,0 1.0 5,0 Составитель С.БандринРедактор М,Недолуженко Техред М,Моргентал Корректор М.Пожо Заказ 2169, Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР . 113035, Москва, Ж, Раушская наб.; 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101 Е.соИ К 802ЕРВ .ЧЗГ 6 1744110с Вывод прокта,