Способ выделения хитиназ из культуральной жидкости астinомyсеs kurssanovii 93 — SU 1756354 (original) (raw)

ОЮЗ СОВЕТСКИСЦИАЛИС ГИЧЕСКЕСПУБЛИК 1756354)5 С 12 М 9/26 К АВТОРС ВИДЕТЕЛ ЬСТВ получениюаз, продуциоб не позволяет й степени оцист- оставляеттолько свыше иэ культу- огззапочИ на иминоряженную уравнове- рН 6,0-7,5, рН 6,0 - 7.5, т две фракпснижения 3,8 - 4,5, по-. ций белков ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЭОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Институт элементорганических соединений им, А.Н, Несмеянова, Институт биохимии им, А.Н. Баха(56) ВОЬегтз В.1., СаЬ 1 Ь Е, Яегга 11 а гпагсезсепз сЫт 1 пазе: опе-зтер рогйсат 1 оп апб цзе ХогтЬе бе 1 еггп 1 пат 1 оп о 1 сЫПп. -Апа, В 1 осЬеп 11982, 127, р, 402-412.Авторское свидетельство СССР В 413189, кл. С 12 й 9/26, "973.(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ХИТИНАЗ ИЗ. КУЛЬТУРАЛ ЬНОЙ ЖИДКОСТИ АСТ 1 ИОМУСЕЯ КОЯЯЯАКОИ 1 93(57) Изобретение относится кФерментов, в частности хитин Изобретение относится к способам выделения и очистки ферментов хроматографией, конкретно к способам выделения хитинаэ иэ Когззапоч 1193.Известен способ выделения хитиназ иэ культуральной жидкости путем сорбции ферментов на хитине с последующим его гидролизом хитиназами. Этот метод привО- дит к потере более 6000 исходной хитиназной активности и не позволяет разделить ферменты, близкие по сродству к хитину.Наиболее близким к предолженному по технической сущности и достигнутыми результатам является способ выделения хитиназ из культуральной жидкости Асс. КагззапочП 93 осаждением фермента этиловым спиртом или сульфатом аммония. руемых актиномицетами. Целью изобретения является повышение степени очистки хитинаэ. Изобретение заключается в том, что хитиназы (Х 1, Х 11, Х 111) выделяют непосредственно иэ культуральной жидкости Асбповусез Когззапоч 1193 в две стадии; лигандообменной хроматографией на иминодиуксусной агарозе, заряженной ионами двухвалентной меди, путем ступенчатого понижения рН сначала от 6,0 - 7,5 до 4,8-5,6, затем до 3,8-4,5 (первая и вторая фракции соответственно). После этого Фракции подвергают дополнительной очистке с по-. мощью гидрофобной хроматографии на бутил-Тойоперле в градиенте концентрации сульфата натрия от 1,5-1,0 М до О, хитиназы вымывают фосфатным буфером, содержащим сульфат натрия в концентрации 0,1-0,2 1 ч 1 и не содержащим сульфат натрия, Степень очистки до 25, 2 табл. Однако, данный спосполучать ферменты высококи. Активность препарата с18 - 22 ед/мл.Целью изобретения являетсние степени очистки хитиназ,Способ выделения хитинаэральной жидкости Аст 1 погпусеззаключается атом, что ее наносядиуксуснокислую агарозу, эаионами двухвалентной меди ищенную буфером, создающимвымывают балластные белки призатем последовательно злюируюции белков путем ступенчатогорН сначала до 4,8-5,6, затем досле чего каждую из двух фракпосле доведения в них рН до 6,8 - 7,2, наносят на бутил-Тойоперл 650 М, уравновешенный буфером, создающим рН 6,8-7,2 и содержащим сульфат натрия с концентрацией 1,0-1,5 М, затем примеси первой фракции вымывают раствором сульфата натрия с концентрацией, понижающейся с 1,0-1,5 до 0,1 М, а хитиназу вымывают фосфатным буфером с концентрацией 0,01-0,02 М, примеси второй фракции вымывают раствором сульфата натрия с концентрацией. понижающейся с 1,0 - 1,5 до 0,3-0,4 М, хитиназу с мол,м, 26 кДа вымывают раствором сульфата натрия с концентрацией 0,1 - 0,2 М, хитиназу с мол,м, 42 кДа вымывают фосфатным буфером с концентрацией 0,01 - 0,02 М.Способ осуществляется следующим образом,На колонку с иминодиуксуснокислой агарозой, заряженной ионами двухвалентной меди и уравновешенной буфером с рН 6,0-7,5, содержащим 0,5-1,0 М хлористого натрия, наносят культуральную жидкость Астпотусез Кцгввапо Л 93 в объеме, равном обьему колонки, Элюцию проводят со скоростью 0,8-1,0 мл/мин при ступенчатой смене буферов следующего состава:А - 0,1 М натрий-ацетатный буфер., рН 6,0-7,5, содержащий 0,5-1,0 М хлористого натрия;Б - 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 4,8-5,6, содержащий 0,5-1,0 М хлористого натрия;В - 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН3,8-4,5, содержащий 0,5 - 1,0 М хлористогонатрия. При этом на колонке не сорбируютсяР -М-ацетилглюкозаминидаза, протеазы(80 О протеазной активности культуральной жидкости) и другие примеси. Белки, обладающие хитиназной активностью по коллоидному хитину, которую оценивают по количеству восстанавливающих сахаров с помощью 3,5 динитросалициловой кислоты, элюируютпутем ступенчатого понижения рН сначала буфером Б, а затем буфером В (первая и вторая фракции соответственно).В каждой из двух фракций белков доводят рН до 6,8 - 7,2, послечего их наносят на колонку с бутил-Тойоперлом 650 М, уравновешейным 0,1 М натрий-фосфатным буфером рН 6,8 - 7,2, содержащим 1,0 - 15 Мсульфата натрия, Злюцию проводят убывающим градиентом концентрации сульфатанатрия, задаваемым автоматическим смесителем в течение 2 ч, со скоростью 0,8-1,0мл/мий, Начальный буфер: 0,1 М фосфатный буфер, рН 6,8-7,2, содержащий 1,0-1,5 М сульФата натрия, конечный буфер: 0,01- 0,02 М фосфатный буфер, рН 6,8-7,2,Примеси первой фракции элюируют вградиенте концентрации сульфата натрия,хитиназу(Х) вымывают 0,01-0,02 М фосфатным буфером рН 6,8-7,2, примеси второйфракции вымывают раствором сульфата натрия с концентрацией, понижающейся от1,0-1,5 до 0,3-0,4 М, хитиназу с мол.м, 26кДа (Х) вымывают раствором сульфата натрия с концентрацией 0,1 - 0,2 М, а хитиназус мол.м, 42 кДа (Х) вымывают 0,01-0,02 Мфосфатным буфером рН 6,8 - 7,2, не содержащим сульфата натрия.Если иминодиуксуснокислую агарозу,заряженную ионами двухвалентной меди,уравновесить буфером, имеющим РН меньше 6,0, и проводить сорбцию белков культуральной жидкости Астпогпусез КцгззапМ93 при этом рН, то хитиназа первой фракциине будет задерживаться на колонке, а будетэлюироваться вместе с балластными белками, что исключает ее выделение в индивидуальном виде;Если рН уравновешивающего буфера ибуфера А больше 7,5, происходит частичнаяинактивация ферментов,Если первую фракцию белков вымыватьс иминодиуксуснокислой агарозы при рНменьше 4,8, не удается ее полностью отделить от второй фракции, при рН больше 5,6,хитиназа не эпюируется с сарбента.Если вторую фракцию белков вымыватьс сорбента при рН меньше ЗЯ, происходитчастичная инактивация ферментов, при рНбольше 4,5, фракция не элюируется с иминодиуксуснокислой агарозы,Интервал рН 6,8-7,2 соответствует минимуму потерь хитиназной активности, поэтому данный интервал рН использован дляхроматографической очистки первой и второй фракций белков на бутил-Тойоперле.Уравновешивающий буфер содержит сульфат натрия в концентрации 1,0 - 1,5 М. Применьшей концентрации наблюдается неполная сорбция хитиназ, при более высокойконцентрации - высаливание белков,Хитиназа, содержащаяся в первойфракции, элюируется с бутил-Тойоперла в0,01 - 0,02 М фосфатном буфере. Если проводить элюцию буфером с концентрациейбольше 0,02 М или меньше 0,01 М, не произойдет полного элюирования фермента,По аналогичным соображениям выбран интервал концентрации сульфата натрия 0,10,2 М для элюирования хитинази второйфракции.Осуществление способа в обьеме изложенных признаков позволяет получить препараты высокоочищенных ферментов,гомогенных по данным злектрофореза в полиакрил амидном геле в денатурирующих условиях, имеющих активность, 0,90,02 мкМ/мг млн, (Х 1), 1,59 + 0.02 мкМ/м мин (Х 11), 5,13 + 0,02 мкМ/мг мик (Х 111), что превышает активность продукта, получаемого по известному способу в 5, 10 и 32 раза соответственно для ферментов Х 1, Хи Х 111,Иминодиуксуснокислая агароэа, заряженная ионами двухвалентной меди, ранее использовалась для разделения Ферментов класса нуклеаз, однако она не 10 использовалась для разделекия карбогидраз, к которым относятся хитиназы; указанная функция носителя не вытекает с очевидностью из его извстных свойств. П р и м е р 1. Колонку с иминодиуксуснокислой агарозой заряжают ионами меди промыванием колонки пятью обьемами 0,5 М раствора сульфата меди, уравновешивают 0,1 М натрия - ацетатным буфером рН 20 6,5, содержащим 0,5 М хлористого натрия На колонку(2,0 4,5 см) наносят 15 мл культуральной жидкости. Элюцию проводят со скоростью 0,8 мл/мин при ступекчатойсмене буфером следующего состава; 25 А - 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 6,5. содержащий 0,5 М хлористого натрия; Б - 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН5,0, содержащий 0,5 М хлористого натрия, В - 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 30 4,0, содержащий 0,5 М хлористого натрия,обьем фракций 4 мл. Хитиназная активность была обнаружена во фракциях белков, элюирующихся буФерами Б и В. Каждую из этих фракций после доведения рН до 7,0 наносят на коланку с бутил-Тойоперлом 650 М, уравновешекную 0,1 М натрий-фасфаткым буфером рН 7,0, содержащим 10 М сульфата натрия. Размер колонки (2,5 х 7,5 см), наносят 16 оптических единиц(280 км). Элюцию право дят линейным градиентом сульфата натрия от 1,0 до О М, задаваемым автоматическим смесителем Ультраград, со скоростью 0,8 мл/мин в ечение 2 ч. Начальный буфер: 0,1 М натрий-фосфатный, рН 7,0, содержащий 451,0 М сульфата натрия; конечный буфер:0,02 М натрий-фосфатный, рН 7,0. После этого колонку промывают конечным буфером.П р и м е р 2-9, Способ осуществляется аналогично примеру 1.Режимы его проведения представлены в табл.1, активность полученного продукта проведена в табл, 2.Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить степень очистки хитиназ Х 1, Х 11, Х 11 из культуральной жидкости Аспотусез КогззапочИ 93 в 5, 10 и 32 раза соответственно,Фбрмула изобретения Способ выделения хитиназ из культу- ральной жидкости Ас 11 повусез Кцгззапоч 11 93, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения степени очистки хитиназ. культуральную жидкость наносят на иминодиуксуснокислую агарозу, заряженную ионами двухвалентной медии уравновешенную 0,1 М натрий-ацетатным буфером рН 6,0 - 7,5, содержащим хлористый натрий, отмывают балластные белки затем последовательно элюируют две фракции белков путем ступенчатого понижения рН сначала до 4,8-5,6, затем до 3,8-4,5, в каждой из двух фракций доводят рН до 6,8-7,2, после чего наносят их на бутил-тойоперл 650 М, уравновешенный 0,1 М натрий-фосфатным буфером рН 6,8 - 7,2, содержащим 1,0-1,5 моль сульфата натрия, вымывают примеси первой фракции тем же буфером с сульфатом натрия в убывающем градиенте концентрации от 1,0-1,5 до 0,1 моль, а элюцию хитиназы осуществляют убывающим ат 1,0-1,5 до 0 мол. градиентом концентрации сульфата натрия в 0,01-0,02 М натрий-фосфатном буфере, при этом примеси второй фракции вымывают буферным раствором, содержащим сульфат натрия в убывающем градиенте концентрации от 1,0-1,5 до 0,3-0,4 моль, хитиназу с мол,м; 26 кДа вымывают раствором, содеожащим сульфат натрия в концентрации 0,2- 0,1 моль, а хитиназу с мол.м, 42 кДа вымывают 0,01-0,02 М иатрий-фосфатчым буфером,1756354 таблица Ькэзэтели для способа по примеру Условия разделения г т а г56 7 8 9г та г 3г е. рН буфера, уравновеюива"ущего ИДК-агарозу 6,0 7,5 7,0 , 7,0 7,0 7,0 7,5 5,0 рН элюирования балластныхбелков 6,0 7,0 7,5 5,О 7,О 7,О 7,0 7,О 6,0 5,0 5,0 4,4 4,8 5,0 4.9 0 3,0 4,7 4,0 3,8 3 р 9 4,0 4,0 7,0 7,2 70 7,0 6,8 6,9 6,9 7,0 рН буфера,уравновешиваютщего бутип-тойоперл Концентрация,м сульфата натрия вуравновешивающем буФере 1,0 1,5 1,0 1,3 1,0 1,О 1,О 1,0 0,2 02 0,2 то же в элюирующемрастворе 0,2 Ор 2 Ор Ор 2 Ор 2 0,02 0,01 0,015 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 фосфатного буфера в га гаиееиеатт гагат гаеаветевтевгтиттии тивиеие тТаблица 2 мкНС/сНАс Активность,гтра Р (мин мг)102Способ по примеру Примечание т итти г в тгв Предлагаемый Х 1 "92, Х П -160, Х П 1-515 Х 1 а 09, Х П г 159, Х 1 Пг 5 О Х 1-90 р Х 1 а 00,Х П - 160, Х ХП" 512 Х П -158, Х ТП -513 Первая фракция не отделяетсяот балластных белков Первая и вторая фракции неразделяются Первая и вторая фракции бел"ков не разделяются Частичная инактивэция Фермен-,тов Концентрация белка 1 мгlмл Известный 18 а 22 Ьгт ттеееаата т тагаева гттвеиетеСоставитель ИЯриваловаТехред М.Моргентал . Корректор С,Патрушева Редактор Н.Рогулич Заказ 3062 Тираж йодг 1 исное ВЙИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Рауц 1 ская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат Патент", г, Ужгород,ул.Гагарина, 1 О оН элюций первой фракциибелков, содержащих РРхитиназу ,4. рН элюции второй Фракциибелков, содержащих хитиназу Плохое разделение первой ивтором Фракции белков

Смотреть

Способ выделения хитиназ из культуральной жидкости астinомyсеs kurssanovii 93