Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus продуцент моноклональных антител, используемых для диагностики болезни ибараки — SU 2004589 (original) (raw)
(5 Ц 5 С 12 1 Ч 5 00 ОПИС К ПАТЕНТУ ИЕ ИЗОБРЕТЕ селезенки мочищеннымШтамм депоТитр монокпжидкости (вПри внутриВА(.В/с кпетопухолей с т1: 20000. АкД ВБИ подципитации. М"сэндвич" -вступают в лными антигецифичны, позруса катараппопьзованыпрепаратов. инстиии М.Б.; инстиииУЕЦЕНТЬЗУЕ- АРАКомитет Российской Федерации по патентам и товарным знака(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРМЫХ КЛЕТОК МОЯ МОЯСООЯ - ПРОДУМОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, ИСПОЛМЫХ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНИ ИБ(57) Использование: иммунология, вирусологи я. Сущность изобретения: штамм гибридных клеток получают при слиянии перевиваемой мышиной миеломной линии Яр 2/О - Ад 14 - 1 с пимфоцитами ыши линии ВА(.В/с, иммунизированной вирусом болезни И бараки (ВБИ). нирован под номером ВСКК (П) 561 Д. ональных антител (МА) в культуральной ТФ ИФА) составляет 1: 128 - 1: 152. брюшинном введении мышам линии ки индуцируют образование асцитных итром МА в асцитической жидкости до нтигенная специфичность к белку 146 тверждена методом радиоиммунопре- А проявляют активность в непрямом и вариантах ИФА с антигеном ВБИ и не ерекрестную реакцию с гетерологичнами Моноклональные антитела спе - воляют идентифицировать ВБИ от виьной лихорадки овец и могут быть исдля изготовления диагностических 1 табл, 2004589Изобретение относигся к биотехнологии. а именно к штамму гибридных клеток, продуцируещему моноклональные антитела к вирусу болезни Ибараки (ВБИ), которые могут быть использованы в диагностических и научных исследованиях.Известны штаммы гибридных клеток, секретирующие моноклональные антитела к вирусам эпизоотической геморрагической болезни оленей (ЭГБО) и катаральной лихорадки овец (КЛО). Полученные моноклональные антитела позволяют идентифицировать вирусы ЭГБО и КЛО, которые являются антигенно родственными . не только между собой, но и с ВБИ. Поэтому для окончательного решения вопроса дифференциальной диагностики болезней, вызванных вышеуказанными вирусами, необходимо иметь моноклональные антитела к ВБИ, которые бы идентифицировали ВБИ от антигенно родственных вирусов.Известны также гибридомы, секретирующие моноклональные антитела к ВБИ, которые получены путем слияния клеток миеломы РЗ х бЗ/А 9 8 с иммунными спленоцитами мышей линии ВА 1 В/с, Иммунизацию мышей проводят очищенным препаратом вируса болезни Ибараки путем внутримышечного введения с адьювантом Фрейнда и последующей трехкратной интраперитонеальной иньекцией с недельным интервалом, Скрининг гибридом на предмет продукции антител ведут в непрямом иммунопероксидазном методе, В результате были получены 5 гибридом, продуцирующих анти-ВБИ антитела изотипов 963, 9 С 2 Ь и 1962 а к белкам с мол.м, 24 и 78 кД. Однако не дается полной характеристики штаммов гибридных клеток и секретируемых моноклональных антител эа исключением иэотипа и полипептидной специфичности, Не показана воэможность использования полученных моноклональных антител для диагностики болезни Ибараки, а именно для выявления антигена в органах зараженных ВБИ животных, а также для обнаружения антител в сыворотках крови больных животных,Как видно из вышеизложенного отсутствуют данные по получению штамма гибридных клеток, се кретирующего моноклональные антитела, которые бы использовались для диагностики болезни Ибараки,Задачей изобретения является получение штамма гибридных клеток животных, продуцирующего моноклональн ые антитела к вирусу болезни Ибараки, используемые в диагностических целях.45 50 55 Полученный штамм ВБИ х Яр 2/О - 201 о х х 90 имеет следующие морфологическую и физиологическую характеристики.Культура состоит иэ клеток округлой формы различной величины с ядром, занимающим большую часть клетки и расположенным эксцентрично, Каждое ядро содержит 2 - 4 ядрышка. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка. Кариотип соответствует мышиному, Модальный класс 89 хромосом (модальный класс для родительской миеломной линии Яр 2/О - А 9 14,1 72 хромосомы). В кариотипе клеток идентифицированы б-я и 12-я хромосомы, несущие структурные гены иммуноглобулинов,Предлагаемый штамм обозначен какВБИ х Яр 2/Оо90 и хранится во Всесоюзной специализированной коллекцииклеточных культур (ВСКК (П института ци 5 тологии АН СССР под номером 561 Д,Штамм гибридных клеток ВБИ х Яр2/0-2010 90 получают путем гибридизации мышиной миеломной линии Зр 2/ОА 914,1 с лимфоцитами селезенки иммунныхмышей линии ВА В/С, Для получения популяции иммунных лимфоцитов мышей иммуниэируют очищенным на 25 ф(а/ч)"сахароэной подушке", препаратом вируса,который получают иэ культуральной жидкости зараженной ВБИ культуры клеток почкисибирского горного козерога (ПСГК),В первый день вводят внутрибрюшинно200 мкл очищенного вируса (10вир,част,/мл) с равным объемом полного20 адаюванта Фрейнда. Через 10 дней инъекцию повторяют,.Спустя три недели вводят250 мкл вирусного препарата внутривенно.Гибридизацию проводят на 4-й день послевведения бустер-дозы, Слияние клеток миеломы с лимфоцитами осуществляют в соотношении 1;10 в присутствии 504полиэтиленгликоля с мол,м, 4000. Культивирование гибридных клеток ведут на среде,содержащей гиноксантин, аминоптерин, тиЗ 0 мидин, Продукцию специфических антителопределяют в непрямом варианте твердофаэного иммуноферментного анализа(ИФА) с антигенами вирусов болезни Ибараки и КЛО. При этом используют очищенныйЗ 5 препарат вируса иммобилизованный намикропластины, Клоны, дающие положительную реакцию в ИФА только с ВБИ, отбирают и дважды клонируют в "мягком"агаре с целью получения стабильных штам 40 мов клеток. Клон считают стабильным, еслипри последующем клонировании не менее90 субклонов сохраняют продукцию антител, 200458950 Клетки обладают слабой адгезивной способностью. Тип роста - стационарная суспензия, Клетки легко снимаются при встряхивании или пипетировании, образуя мелкую однородную взвесь, Частота пассирования 1 раз в 2 - 3 дня. Коэффициент пере- сева 1:2 - 1,3, Посевная доза 200-250 тысяч клеток в 1 мл.Среда культивирования - модифицированная Дульбекко, среда Игла с содержанием 15 эмбриональной сыворотки теленка, 2 мМ глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 50 мкг/мл гентамицина. Оптимальный рН среды 6,8 - 7,2,При хранении в условиях низких температур клетки сохраняют жизнеспособность в течение 6 мес при -70 С и неограниченно долго в жидком азоте (-196 С). Клетки хранят в пластиковых ампулах после 2-кратного клонирования в "мягком" агаре и пассирования на мышах линии ВА В/с. Концентрация клеток при криоконсервировании составляет 5 - 10 млн/мл, Криоэащитная среда - ростовая среда с добавлением 40 эмбриональной сыворотки теленка и 10 диметилсульфоксида. Жизнеспособность клеток после замораживания 70 - 72 .Контаминации бактериями, грибами и микоплазмами не обнаружено.Гибридные клетки штамма ВБИ х Яр 2/О - 201 о 90, сохраняют стабильную продукцию моноклональных антител в культу- ральной среде на протяжении 27 пассажей (срок наблюдения), При введении предлагаемых клеток в брюшную полость мышам ВА В/с в количестве 1 - 2 млн. на мышь, предварительно сенсибилиэированных пристаном, образуются асцитные опухоли. Асцитические жидкости (3 - 7 мл на мышь) получают на 10 - 14 день после инокуляции клеток. Антитела, продуцируемые предлагаемым клоном, относятся к иммуноглобулинам класса 61, Иммуноглобулины выделяют солевой преципитацией с последующей очисткой на протеин-А сефарозе.Методом радиоиммунопреципитации определена полипептидная специфичность к белку с мол.м. 46 кД.Следовательно, штамм гибридных клеток ВБИ х Яр 2/О - 20 ю90, секретирующий 5 10 15 20 25 30 35 40 45 моноклональные антитела к ВБИ, отличается от известного прототипа и обладает существенными преимуществами, Так предлагаемый штамм продуцирует иммуноглобулины изотипа 61 и обладает пол ипептидной специфичностью к ВП 46, Кроме того, данные моноклональные антитела могут быть использованы как для выявления антигена, так и для обнаружения антител в сыворотках больных животных.Для выявления специфического антигена в суспензиях из органов зараженных лабораторн ых животных, а также иэ культуральной жидкости зараженной культуры клеток используют "сэндвич" - вариант ИФА. При этом моноклональными антителами сенсибилизируют 96-луночные пластины (1 - 2 мкл на лунку) в течение 16 ч при 4 С, а затем вносят исследуемые пробы. Выявление антигена, связавшегося с подложкой, проводят пероксидазным коньюгатом на основе этих же моноклональных антител,С целью выявления антител в сыворотках крови больных животных применяют двойной антительный "сэндвич" - вариант ИФА (ДАС-ИФА) методом ингибирования, Для этого к иммобилизованным моноклональным антителам добавляют специфический антиген в рабочем разведении, а затем после инкубации и промывки вносят исследуемые сыворотки, По истечении времени инкубации (1 ч, 37 С) и последующей промывки вносят пероксидазный конъюгат с анти-ВБИ-моноклональными антителами. О наличии специфических антител в сыворотках судят по подавлению свечения субстратного раствора.Таким образом, штамм гибридных клеток ВБИ х Яр 2/О - 201 о 90 может быть использован для наработки моноклональных антител, специфичных к вирусу болезни Ибараки, Продуцируемые штаммом моноклональные антитела позволяют идентифицировать ВБИ от КЛО и могут быть промышленно применимы для изготовления диагностических препаратов.2004589 Сравнительная характеристика моноклональных антител. секретируемых предлагаемым штаммом и прототипомент моноклональн спользуемых для диаг бараки,Формула изобретейия Штамм гибридных культивируемых клек Мцз вцзсццз ВСКК(1) И 561 Д - продуоставитель А.Семенихиехред.М.Моргентал орректор М. Керецмодписное Тираж НПО "Поиск" Роспатент13035, Москва, Ж, Раушская н Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул, Гагарина, 101 Реда кто Заказ 3 антите тики болеэн