Способ получения биомассы — SU 578901 (original) (raw)
ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИяК ПА 1 ЕНе У Союз СоветскихСоциалистицескихРеспублик(32 23) 02.7 ритет осударственныи комитетСовета Министров СССРно делам изооретенийн открытий 1) 7074/7 лик обрит ани ллетень 4 53) УДК 637.127) Авторы изобретен Иностра трик Гоулд (Вели Фрэнсиз Моран лип Альберт Майе(Ирландия)рс (Великобр тания) Иностранная фирма ДЗЕ Бритиш Петролеум Компани Ли71) Заявител БНИЯ БИОМАССЫ 54) СПОСО сферный еде, при ота в пиким обрав протого ков готоая смесь содержит,(предпочтнтельно 1 Изобретение относится к микробиологической промышленности.Наиболее близким к описываемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ получения биомассы, заключающийся в непрерывном культивировании метанутилизирующих микроорганизмов в жидкой питательно 1" среде, содержащей ассимилируемые источники азота и минеральные соли, в присутствии метановоздушной смеси. При этом связанный азот находится в жидкой питательной среде в виде аммонийных или нитратных солей 111 .Недостатком известного способа является использование связанного азота в избыточном количестве, превышающем колиЧество, необходимое для потребления микроорганизмов, что токсично для микроорганизмов, утилизирующих азот и метан.Цель изобретения - частичная замена связанного азота в форме аммонийных или нитратных солей молекулярным азотом атмосферы или полное исключение иэ среды связанного азота.Для этого по предлагаемому способу в качестве метанутилиэирующих микро": организмов используют мнкроорганйзмц 2из рода МеОщ 1 ососсцз, обладающиеспособностью Фиксировать атмоазот, в жидкой питательной срэтом количество связанного аэ 5 тательной среде регулируют тазом,чтобы его уровень в средецессе выращивания был меньшепичества, которое содержитсявой биомассе.0 Из рода МеЬЧГососста испольэуютвид сорзоЕсАизБиомассу по предлагаемому способуполучают путем непрерывного выращивания культуры микроорганизмов нэ рода 5 Ме 1 йфососсоз вида сорзи 8 о 1 иь, утилизирующих метан и атмосферный азот ажидкой питательной среде.Питательная среда содержит мннераль ные соли, источник связанного азота еформе аммонийных илн ннтратнцх солей,кроме тбго в нее подают катано"воэдущнуя; еаажПри этом связанный. азотможет,бытЬ ЦОлностью исключен нэ сос тана питательной среды нлн его количестводолжно еоставлять 95-99 от количества азота, содержащегося в гото.вой биомассе.Метано-воздушнЗО об.Ът метан 10-50 2-25); кц л РОЦ 10,.5 -18,9 Еп 1 едпо"тцтельно 16-:)7); азот 40-72:та смесь может быть Обое.ащеца чистьм кцс.О 11 ы В 1 ер 1 ес 1 не истО 111 икамета 1 а 1 ИЕжет быть испо 1 зон ац, 11 юирОдный газ.Культиниронане 1 е мик 11 оргациз 1 )н п.о.нодят прц повышенно 1 данлециц, например, при 3-4 атм, рн питатс,льцо 11 сре"ды ПОддержиеЗают 45- 80, предцчтительно 5,5-7,0, для чего используют щелочь, например, едкий цатр.Температура среды н процессе выращивания находится н пред .лах от 20 д:60 С преимущестненцо от 35 до 50 О С.-1 " " - 16Оптимальные условия выращивания обеспечинаются прц рН 6,5 и температуре45 С.удельные скорости разбавления составляют от 0,1 до 0,35 ч . при выходебиомассы ст 0,1 до 10 г/л,Согласно изобретецию биомасса мокет быть получена в дне стадии.В первой стадии (стадия подготовкикультуры) выращивают микроорганизмы,утилизирующие молекулярный азот и метан, н жидкой цитатель 1 ОЙ среде, содержащей минеральные соли,.в присутствии источника связанного азота, аммонийных или нитратных солей метанав качестве источника углерода и газа, 30содержащего свободный кислород. Приэтом концентрация клеток микроорганизмов составляет от 1 до 30 г/л.На второй стадии приготонленнуюкультуру непрерывно выращивают в жидкой питательной среде, содержащей минеральные соли, источник связанногоазота, н присутствии метана и газа,содержащего свободный кислород и молекулярный азот, Количество связанно- ,щго азота должно быть меньше того количества, которое- содержится в готовой биомассе. Связанный азот можетбыть вообще исключен из состава питательной среды, В стадии подготовкивыращивание микроорганизмов можно осуществлять как периодически, так и непрерывно.При непрерывной работе удельнаяскорость разбавления должна быть значительно меньше, чем максимальная удельная скорость роста микроорганизмов, аконцентрация связанного азота - несколько больше: требующейся для обеспе-чения потребления азота мйкроорганизмами - от, 2 до,1.00 МХ/ЯИсходной культурой дляинокулирования в стадии подготовки может бытькультура микроорганизма, утилизирующего азот и метан например культу/Юра на косом срезе агара. Ферментаторможно также инокулировать пробами веществ, содержащих микроорганизмы, например почвы или грязи.Если в качестве инокулятора используют пробы вещества, содеркащего мик роарганизьы, то подготовку культуры ведут в две стадии, ца первой из которых из вещества выделяют микроорганизмы, утилизирующие молекулярный азот и метан, а на второй - увеличивают концентрацию клеток указанных микроорганизмов до концентрации, необходимой в продукционной стадии. Лучший источник азота н этой стадии - нитрат или аммиак.Пробы вещества, содержащего микроорганизмы, можно добавлять в непрерывно Действуащую обогатительную систему. Предпочтительным является обогащение н. непрерыннодействующем ферментаторе., содержащем любую вышеописанную жидкую.пйтательную среду с ис- точникоМ азота"н Виде нитратных солей, при условиях, сйосабФтвувщих размножению утилиэирующих молекулярный азот и метан микроорганизмовСкорость разбавлениядолжна быть значительно ниже ожидаемой максимальной скорости роста микроорганизмов. Оптимальная рабочая температура более 40 С, скорость разбавления О,е 5-0,15 ч.Пример.1. Стадия подготовки культуры.500 мл шлама, содержащего метан грязи из отстойника, добавляют с интервалами в течение 5 дней в аэрируемый ферментатор с 5 л жидкой питательной среды следующего состава, мг/л:КН 1 О 1600фОНР 1 1, 12 НО 2928Ма МО 1180Мпво, 7 Н,О 80РеЬО, 7 НО 14Со(МО) 1 11 НО 25СаЬО 5 Н,О4гкьо 17 НО 0,34дпЯцН 20 О,3 ОйаМО, 2 НрО 0,24Дистиллйрованной водой доводято объем до 1 л, Температура 45 С, скорость разбавления 0,084 ч , скорость мешалки Ферментатора 1000 об/мин, рН 6,75 создают добавлением 0,5 н. раствора едкого натра.В ферментатор подают со скоростью 20 об/ч газовую смесь, состоящую иэ 33 об. метана, 64 об. воздуха и 3 об.В двуокиси углерода.Через 7 дней работы при указанных условиях концентрация клеток бактериальной популяции достигает 1,0 г сухого веса на 1 л. Из этой популяции выделяют один штамм бактерий, утилизирующих молекулярный азот и метан; присутствуют в ней и другие типы бактерий, не утилизирующих Метан. Соотношение клеток бактерий, утилизирующих метан и молекулярный азот, и клеток бактерий другого типа составляет 90-95 (по количеству) .Бактерии, утилиэирукщие метан и азот, представляют собой капсулооб578901 288 000 64,000 158,000 204,000 286,000 240,000 219,000 О, 330 2,040 О, 330 63,700 286,000 157,700 разные кокки с диаметром 1,1-1,4 мкм,неспособные утилизировать глюкозу.На твердой среде, приготовленнойпутем добавления 1 вес./об, агара кферментационной среде, после инкубирования в течение 10 дней при 45 С ватмосфере метан-воздух (50/50 по объему) колонии имеют следующую морфологию Диаметр 1 мм, белые, гладкие,округленные. По этим характеристикамони сходны с Че 16 уГосогсос сорзоРо 1.оь,но в отличие от них они утилизируют молекулярный азот (как источник азота), метанол и не образуют цистили остаточных стадий,к, Стадия развития культуры, Бактерии, утилизирующие азот и метан, полученные в фазе выделения, выращиваютпри 45 С В 5,0 л питательной средыследующего состава, мг/л:937,5М,НРО 12 Н,О 787,5МЬОр 7 НгО 562,5706,0СаСб (безводный) 112,5Ре 5 О, Н,О 42,7Ма 50(безводный) 225,0СиЬО 5 Н 20 20,5гЬО 7 Н,О 2,5ЙОрМЦО 2 Н 2 ОМпвоНО 1,7СоС 02 бНРО 0,5Вода До 1 лСкорость разбавления 0,18, скоростьперемешивания 3000 об/мин;Культивирование осуществляют приподаче метано-воздушной смеСи, содержащей 18,2 об. метана и 18,:8 об,воздуха. рН 6,5 поддерживают при помощи МаОН и регулируют добавлением Подача азота в виде аммиака, мг/л ч Выделено азота в видепротеина, мг/л ч Потери азота в фермента- торе в вице аммиака в отработанной среде, из расчета наличия 2 мг/л ионов аммония, мг/л ч Чистое поглощение микроорганизмами азота, подаваемого в ферментатор в видеаммиака, мг/луч 1,0-ного раствора МоОН. Азот в виде1,1 н. гидроокиси аммония подают вферментатор при постепенно возрастающей скорости для поддержания концентрации клеток 13 г сухого веса на 1 л,Избыток концентрации ионов аммонг- впитательной среде определяют нэве:т -ным колориметрическим способом в;.робах го 10 мл бульона через каждые5 мин. Избыток ионов аммония в средеподдерживают на уровне 5-10 мг/и рзгулированием скорости подачи гидроскиси аммония в ферментатор, После достижения концентрации клеток 13,7 г с, -хого веса на 1 л культивированиеи о" 15должают еще 24 ч. На этом этапе скорость подачи гидроокиси аммония в ",ерментатор поддерживается постоянной.Скорость працуцирования бактерк:.льных клеток составляет 13,70,18 г (сухой вес) на. 1 л в 1 ч. Выход поегану, т.е. вес клеток, продуцированн-хна единицу веса метана, подаваемогв ферментатор, составляет 0,63. Выходпо кислороду - 0,23.25 й . Стадия получения готового продукта. Подачу в ферментатор гидрсокнси аммония снижают в три стадии: на30, на 65, на 100. Во всех случаях ферментация восстанавливается че- ЗО реэ несколько часов при более низкойконцентрации клеток и необнаружнваемойнизкой концентрации ионов аммония всреде.В таблице приведены данные, полу ченные при установившейся непрерывкойработе на каждой стадии при избыткеиона аьеюония в среде (5-16 мг/л), атакже данные контрольного опыта (получение бисмасс по известному спосо бу)578901 Продолжение табл. Способ получения биомассы Показатель,единица измеренияпредлагаемый по стадиям известный Л.1; Удельная скорость разбав"ления, ч0,17410, 840 О, 179 9,910 0,18013,760 0,17611,760 Концентрация клеток, г/л Продуцирование клеток,г/л ч 2,470 1,770 1, 890 2,070 Концентрация ионов аммония в бульоне, мг/л 12,000 Прибор с пределом чувствительности 2 мг/л не обнаруживает ионов аммо- ния Суммарное содержание азота в клетках,Ъ на сухоевещество 11,600 11,500 11,600 11,600 Содержание готовой биомассыв клетках,В на сухое вещество (количество азота,помноженное на 6,25) 71,900 72,500 72)500 72,500 Формула изобретения Составитель В.МатвееваТехред 3, Фанта Корректор И. Гоксич Редактор Н.Хубларова Эаказ 3838/709 Тираж 541 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 1. Способ получения биомассы путем непрерывного культивирования метанутилизирующих микроорганизмов в жидкой питательной среде, содержащей ассимилируемые источники азота и минераль. ные соли, при подаче метано-воздушной смеси, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью частичной заменй связанного азота в форме аммонийных или нитратных солей мрлекулярным азотом атмосФеры или полного исключения из среды связанного азота, в качестве 45 метанутнлнзирующих микроорганизмов используютмикроорганизмы иэ рода МеОчфососсО 5, обладающие способнос" тью фиксировать атмосферный азот при этом количество связанного азота в питательной среде регулируют таким образом, чтобы его уровень.в среде в процессе выращивания был меньше того количества, которое содержится в готовой биомассе. 2. Способ по п, 1, о т л и ч а ю " щ и й с я тем, что из рода МеВ 4 особфф, используют вид СОР 5 ОЕО 1 ОЬИсточники информации, принятые во внимание при экспертизе:1. Патент Великобритании Р 1150401 кл. С б Р1969