Штамм бактерий еsснеriснiа coli продуцент l-треонина — SU 1694643 (original) (raw)
(22) 26,11.8746 30,11. 1. Б ии. Зт ГОСУДАРС 1 ВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов(56) Авторское свидетельство СССР М 974817, кл. С 12 Р 13/08, 1981.Авторское свидетельство СССРМ 1362021, кл, С 12 Р 13/08, 1981.(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ЕЯСНЕВСНА СО - ПРОДУЦЕНТ Е-ТРЕОНИНА (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий, продуцирующего осится к микробиолоности и касается новой, продуцирующего кислоту 1 -треонин, кокак компонент различмесей медицинского ведобавки в корма жикак реактив для химической промышИзобретение отнгической промышленго штамма бактеринезаменимую аминаторый применяетсяных питательных сназначения, в качествотных, а такжефармацевтической ипенности,Цель изобретпозволяющий пол ения - штамм бактерий учить высокий выход . я)5 С 12 Р 13/08, С 12 М 15/ незаменимую аминокислоту .-треонин, который применяется как компонент различных питательных смесей медицинского назначения, в качестве добавки а корма животных, а также как реактив дпя фармацевтической и химической промышпенностии, Цель изобретения - штамм бактерий ЕзсЬегсЫа со ВКПМ, позволяющий получить высокий выход :треонина в условиях большого числа генераций бактериальной культуры. Штамм содержит рекомбинантную ппазмиду рИС 40, которая в отличие от плазмиды рУМ 7 известного штамма-продуцента стабильно сохраняется при росте культуры без сепективного давления, направленного на поддержание ппазмиды, Предлагаемый штамм позволяет получать до 85 г/л :треонинэ за Зб ч ферментации в лабораторных условиях, В условиях, аналогичных -промышпенной ферментации по числу генераций, продуцирует до 79 г/л :трернина за 50 ч ферментатреонина в условиях большого чи па генераций бактериальной культуры при отсутствии в питательной среде антибиотика.Новый штамм бактерий ЕзсЬег 1 сЮэ соИ ВНИИгенетикасодержит рекомбинантную плазмиду рИС 40, которая в отличие от плазмиды рУМ 7 известного штамма-продуцента-треонина Е;соН ВКПМ В(лабораторный номер ВНИИ- генетика ТДГ-б) стабильно сохраняется при росте культуры без селективного давления, направленного на поддержание ппазмиды, 169464320 25 30 условиях,Новая гибридная плазмида рЧ 1 С 40 получена путем обработки плазмиды рай 7, а 35 40 45 50 но не к пенициллину, и несущая фрагмент плазмиды рУИ 7, детерминирующий ген треонинового биосинтеза у Е.соИ. 55и т.е, в отсутствие в питательной среде антибиотика. Это свойство плазмиды рЧ 1 С 40 позволяет предлагаемому штамму обеспечивать высокий вывод треонина в условиях большого числа генераций .бактериальной культуры, а именно при обогащении питательной среды ростовыми факторами (аминокислотами), а также в условиях промышленного производства.Предлагаемый штамм позволяет получать до 85 г/л треонина за 36 ч ферментации в лабораторных условиях. В условиях, аналогичных промышленной ферментации по числу генераций (клеточных делений) культуры на средах без антибиотиков, штамм продуцирует до 79 г/л 1:треонина эа 50 ч ферментации. Накопление подобных аминокислот (аланин, глицин, глутаминовая кислота) составляет не более 3 г/л,Новый продуцент получен в результатегенетической трансформации плазмидой рЧ 1 С 40 бесплазмидных клеток известного штамма ВНИИгенетика ТДГи сохраняет те генетические свойства известного штамма, которые определяются хромосомой клеток. Новая гибридная плазмида рЧС 40 несет тот же фрагмент хромосомы Е,соИ, что и плазмида рУМ 7, кодирующая ген биосинтеза треонина, и сообщает клеткам устойчивость к антибиотику стрептомицину. В отличие от нее новая плазмида сохраняется в клетках при росте в неселективных также векторной плазмиды, являющейся производной известных плазмид рВЯР 1010 и рВВ 322, характеризующейся высокой стабильностью в клетках Е,соИ, рестриктазами Ваа Н 1 и Рз 11 с последующей обработкой полинуклеотидлигазой. Смесью после лигирования трансформировали клетки бес-. плазмидного варианта штамма ВНИИ-генетика ТДГ, нуждающегося в треонине, и на минимальном агаре (среда Мд), лишенном треонина, но содержащем,стрептомицин (100 мкг/мл), отбирали.колонии трансформантов, утративших устойчивость к пенициллину, Из клеток одного такого трансформанта выделена плазмида рЧ 1 С 40 с молекулярной массой 9,7 МД,.сообщающая устойчивость к стрептомицину,Штамм депонирован во .Всесоюзнойколлекции промышленных микроорганизмов под номером В КПМ Ви имеет следующую характеристику. 5 10 15 Культурально-морфологические признаки. Грамотрицательные слабо подвижные палочки с закругленными концами, размер 1,5 - 2 мкм в длину.Мясо-пептонный агар. Через 24 ч роста при 37 С образует круглые беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5- 3 мм, поверхность колоний гладкая, края ровные или слегка волнистые, центр колоний приподнят, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируется.Агар-Луриа, Через 24 ч роста при 37 С образует беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5 - 2,5 мм, поверхность колоний гладкая, края ровные, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируется.Агаризованная минимальная среда Адамса, Через 40 - 48 ч роста при 37 С образует колонии диаметром 0,5 - 1,5 мм, серовато-белые, полупрозрачные, слегка выпуклые, с блестящей поверхностью.Рост в мясо-пептонном бульоне. Удельная скорость роста при 37 С 1,3 ч . После 24 ч роста происходит сильное равномерное помутнение, имеется характерный запах.Физиолого-биологические признаки.Отношение к источникам углерода; хорошо растет на сахарозе, глюкозе, фруктозе, лактозе, маннозе, галактозе, ксилозе, глицерине, манните с образованием кислоты и газа.Отношение к источникам азота: усваивает азот в форме аммония, солей азотной кислоты, а также азот некоторых органических соединений.Желатину не разжижает. Рост на молоке хороший с коагуляцией молока.Индол не образует.Устойчив к стрептомицину, 1:треонину и 1:гомосерину.Стимулятором роста является -изолейцин. При росте в присутствии 1:треонина аминоацетон не образует.Факультативный анаэроб.Растет на мясо-пептонном бульоне при 37 С и ниже, Оптимальная температура 37 - 38 ОС.Растет на жидких средах, имеющих рН от 6 до 8. Оптимальное значение рН 7,0.Содержание плазмид. Клетки содержат многокопийную гибридную плаэмиду рЧ 1 С 40 (молекулярная масса 9,7 МД), обеспечивающую устойчивость к стрептомицину и несущую гены треонинового оперона.Стабильность плазмиды, Штамм Е.соИ ВКПМ Вхарактеризуется повышенной способностью к сохранению плазмиды при росте безселективногодавления, направленного на поддержание плаэмиды, 1694643Оценку стабильности признаков штамма, определяемого плазмидой, проводили у предлагаемого (плазмида рИС 40) и известного (плазмида рай 7) штаммов. Клетки обоих штаммов выращивали в присутствии соответствующего антибиотика до ранней стационарной фазы и засевали среду Луриа, лишенную антибиотиков, с исходным титром 5. После 48 ч культивирования полученными клетками вновь засевали такую же среду до исходного титра 50 и вновь инкубировали 48 ч. Каждый пассаж соответствовал 20 генерациям. После указанных пассажей клетки высевали на агаре Луриа и выросшие колонии проверяли на устойчивость к стрептомицину и пенициллину (табл,1).Иэ данных табл.1 видно, что плазмида рИС 40 стабильно сохраняется в клетках нового продуцента в неселективных условиях. В этих же условиях клетки известного штамма быстро утрачивают плазмиду. 10 15 20 Получение 1:треонина с использованием нового штамма-продуцента осуществляют следующим образом, Культуру штамма Е.со 1 ВКПМ Ввыращивают на агаризованной среде Адамса со стрептомицином и суспензией клеток, выращенных таким же образом, засевают жидкую посевную или ферментационную среду. Эти среды содержат источник углерода, азота, необходимые минеральные соли, а также питательную добавку в аиде гидролизатов белковых субстратов (присутствие этой добавки в ферментационной среде не обязательно). Выращивание посевного материала ведут в условиях рН-статирования при рХ 6,8 - 7;2, температуре 36 - 38 С с непрерывным аэоированием и перемешиванием, Приготовленный таким. образом посевной материал или суспензию клеток, смытых с агара, используют для засева ферментационной среды, содержащей источник углерода, азота, ми 40 неральные соли, а также питательную добавку в виде гидролизатов белковых субстратов (при низких дозах засева указанная добавка позволяет сократить продолжительность ферментации, при высоких 38 С с непрерывным азрированием и перемешиванием. В качестве рН-статирующего агента применяют либо аммиачную воду, либо сбалансированную по углероду и азоту сахаро-аммиачную подпитку. Продолжительность ферментации зависит отдозы эадозах засева присутствие ее не обязатель но).Ферментацию осуществляют в ферментерах, оснащенных системой рН-статиро-, вания, при рН 6,8 - 7,2, температуре 36 - "сева и степени обогащения ферментационной среды ростовыми факторами и может составлять 24 - 60 ч. К концу ферментации накапливается 70 - 85 г/л 1:треонина. Удельный расход источника углерода на синтез 1 г 1-треонина составг яет 2 - 2,3 г, Накопление аминсацетона в культуральной жидкости отсутствует,П р и м е р 1,Культурыштаммов ВКПМ Ви ВКПМ Впараллельно выращива.от на агаризованной среде Адамса, содержащей сахарозу (0,2,) и антибиотики (500 ед/мл пенициллина для известного штамма и 100 мкг/мл стрептомицина для предлагаемого штамма). Клетки, выращенные в течение 2 сут, суспендируют в физиологическом растворе и 10 мл суспензии с титром 10 используют для засева 500 мл посевной среды следующего состава, %: сахароза 4; аммоний сернокислый 0,5; калий фосфорнокислый 2-замещенный 0,2; магний сернокислый 7-водный 0,04; железо (11) сернокислое 7-водное 0,002; марганец (11) сернокислый 5-водный 0,002; автолизат дрожжей 0,2; вода остальное,Посевной материал выращивают в течение 20 ч в лабораторных ферментерах емкостью 1,2 л при аэрировании (0,5 л/мин) и перемешивании со скоростью 1000 об/мин при 37 С. Значение рН автоматически поддерживают в пределах 6,9 + 0,2 аммиачной водой. Выращенным посевным материалом с титром 7 - 8 10 в количестве 50 мл засевают ферментационные среды обьемом 500 мл. Состав ферментационной среды такой же, как и состав посевной, но концентрация сахарозы 3;4 и дополнительно внесен хлористый натрий (0,06%),Ферментацию проводят в лабораторных ферментерах емкостью 1,2 л при аэрировании 0,5 л/мин воздуха и перемешивании соскоростью 1200 об/мин и при температуре культивирования 37 С. Значение рН поддерживают в пределах 6,9 К),2 путем автоматичсской подачи сахаро-аммиачной подпитки, представляющей собой смесь 70,-ного раствора сахарозы с 25%- ной аммиачной водой в соотношении 3,6:1 по обьему. Ферментацию проводят в течение 36 ч. Результаты проведенного процесса показаны в табл,2,П р и м е р 2. Культуры штаммов Е, со 11 В КП М Ви В КП М Ввы ра гци ва ют аналогично примеру 1, но полученную клеточную суспензию разводят физиологическим раствором до титра 10 и 1 мл такой2суспензии используют для засева 500 мл ферментационной.среды, отличающейся от указанной в примере 1 ферментационной среды повышенным до 0,5/. содержанием1694643 Таблица 1 Доля клеток известного и предлагаемого штаммов, утративших плаэмиды при пассировании в среде ЛуриаТаблица 2 Накопление треонина и утрата плазмиды у известного и предлагаемого штаммов при культивировании на средах беэ антибиотиков в лабораторных ферментерахавтолизата дрожжей (моделируется вариант засева производственного ферментера объемом 1000 м суспензией клеток, смытых с 1 косяка). Ферментацию проводят втечение 50 ч в условиях, аналогичных указанным в 5 примере 1. Результаты проведенного процесса показаны в табл.3.П р и м е р 3, Культуру штамма ВКПМ Ввыращивают на агаризованной среде Адамса со стрептомицином, как показа но в примере 1, затем клетки суспендируют в физрастворе и полученной суспенэией засевают. посевную среду, аналогичную приведенной в примере 1, но отличающуюся заменой сахарозы на мелассу(4 по саха ру). Выращивание посевного материала ведут по примеру 1. Через 18 ч готовым посевным материалом засевают ферментационную среду, содержащую 4; мелассы (2 о по сахару), 1,5 сернокислого аммо ния и минеральные соли, перечисленные в ферментационной среде примера 1. Для рН-статирования в ходе ферментации используют мелассно-аммиачную подпитку, представляющую собой смесь 30 О/-ного по 25 сахару раствора мелассы с 25-ной аммиачной водой в соотношении 12:1 по объему. Ферментацию проводят в течение 36 ч.К концу ферментации в культуральной 30жидкости накапливается треонин в концентрации 44 г/л. Доля клеток, утративших плазмиду, менее 1.Сравнение предлагаемого и известного штаммов в условиях небольшого числа клеточных генераций без антибиотика (пример 1) показывает одинаковую продуктивность штаммов (82 - 85 г/л).Преимущества предлагаемого штамма проявляются в условиях большого числа клеточных генераций (пример 2), т.е, в условиях, моделирующих производственные в отсутствие антибиотика. В этом случае уровень накопления треонина предлагаемым штаммом в 1,5 раза выше, чем у известного штамма (79 г/л треонина против 53 г/л). Это объясняется тем, что значительная доля клеток известного штамма на обогащенных средах без антибиотиков утрачивает плазмиду, в то время как потери плаэмиды у предлагаемого штамма в этих условиях не отмечены.Таким образом, предлагаемый штамм позволяет в производственных условиях увеличивать выход :треонина и упростить процесс за счет полного исключения применения антибиотика в процессе выращивания посевного материала,Ф о р мул а и зо бр е те н ия Штамм бактерий ЕзспегсЫа соП ВКПМ В-продуцент :треонина.1694643 Таблица 3 Накопление треонина и утрата плазмиды у известного и предлагаемого штаммовпри культивировании на средах без антибиотиков в условиях, моделирующих почислу генераций производственные условия Редактор М.Петрова Техред М.Моргентал Корректор; М,Демчик Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул, Гагарина, 101 Заказ 4130 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5