Штамм культивируемых клеток растений аrisтоlоснiа маnsнuriеnsis ком., используемый для получения препарата, обладающего кардиотропной активностью (original) (raw)
(5 Ц 5 С 12 й 5/О ПИСАНИЕ ИЗСБРЕ 1 ЕНИЯ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЪСТВУ(71) Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения АН СССР, Тихоокеанский институт биоорганической химииДальневосточного отделения АН СССР иВсесоюзный научный центр безопасностибиологически активных веществ(56) Авторское свидетельство СССРМ 1551736, кл. С 12 й 5/00, 1988,(54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОКРАСТЕНИЙ АВ 1 ЯТО ОСН 1 А МАИЯНОВ 1 ЕЙЯЯ Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности.Впервые Агзсо 1 осйа аапзМгепз 1 з Кое. введена в культуру в форме штамма А 1, который специализирован для биосинтеза аристолохиевых кислот, веществ противоопухолевого действия и кардиотропной активностью не обладает.Таким образом, предлагаемый штамм А 2, используемый для получения препарата, обладающего кардиотропной активностью, аналогов не имеет.Цель изобретения - получение активно растущего штамма клеток кирказона маньчжурского, обладающего кардиотропной акти в ность ю. КОМ ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯПРЕПАРАТА, ОБЛАДАЮЩЕГО КАРДИОТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬЮ(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности. Цель изобретения - получение активно растущего штамма клеток кирказона маньчжурского, обладающего кардиотропной активностью, Штамм Аг кирказона маньчжурского получен в результате генетической трансформации и селекции клеток кирказона, Штамм характеризуется высокой скоростью роста на безгормональных средах, Из биомассы штамма А 2 получен препарат, обладающий профилактическим антиангинальным, антигипоксическим, противоа ритмическим и кардиопротекторным действием. Зтабл. Штамм АГ 1 зтоосЫа вапзЬцг 1 епз 1 з (А 2) получен в результате генетической трансформации клеток кирказона и депонирован во Всесоюзную коллекцию клеток высших растений ВСКК(ВР) при Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева АН СССР под коллекционным номером 37.Описание исходного материала. Исходным материалом для получения штамма А 2 были пробирачные стерильные растения Аг 1 з 1 оосЫа папзЬогепзз, выращенные из почек многолетней дикорастущей лианы, заготовленной в декабре 1986 г, в Надеждинском районе Приморского края. Штамм А 2 получен из дисков стерильных пробирочных растений, инокулированных агробактериями АдгоЬасйегЬгп сцеетасепз С 58. и представляет собой культуру трансформи 1708836рованных гормононезависимыхопухолевыхклеток, выращиваемую на агаризованнойлибо в жидкой среде.Культуральные свойства., Растущая каллусная культура представляет собой тканьрыхлой консистенции кремового и беложелтого цвета без запаха. Ростовой индекс31 ч. 0,6 для каллусов начальной массой150 мг. Растущая в жидкой питательной среде культура представлена агрегатами кремового цвета размером 1-3, реже 3 - 5 мм.Накопление биомассы 200 - 250 г сырого веса на 1 л при посевной дозе 40 г/л. ШтаммА 2 выращивают при 25 й 1 С, относительной влажности воздуха 700/, в темноте напитательной среде следующего состава,мг 1 л воды:ИН 4 ИОЗ 350-450КИОЗ 1500-2300КН 2 Р 04 150-190СаС 2 6 Н 20 600-730М 98047 Н 20 350-400НзВОз 4,2-8,0Мп 3044 Н 20 15,6 - 26,7Со 5045 НгО 0,02 - 0,03СоСЬ 2 НгО 0,02-0,03ЪЯО7 Н 20 6,0 - 10,3йагМо 04 2 Н 20 0,2-0,3К 0,52 - 0,90Ге 304 7 Н 20 25,0 - 30,6йагЕОТА 2 Н 20 33,6-41,0Тиамина гидрохлорид 0,15 - 0,25Пиридоксина гидрохлорид 0,40-0,60Никотиновая кислота 0.40-0,60Мезо-инозит 80 - 120Цистеина гидрохлорид 4-6Сахароза 25000-30000Агар 5800-6200рН среды 5,2-5,6Ткань культивируют в колбах Эрленмейера емкостью 100 мл, содержащих 40 млсреды, Продолжительность цикла выращивания ткани 30 дней, номер пассажа 33-й.При варианте культивирования в жидкойсреде культуру выращивают в колбах Эрленмейера емкостью 500 мл на качалках соскооостью встряхивания 100 об/мин и амплитудой 25 мм. Каждая колба содержит 100мл среды указанного состава без агара,цикл выращивания 2 недели.Цитологические и кариологические характеристики штамма Аг,Ткань представляет собой гетерогеннуа популяцию, состоящую из трех группклеток. Первая группа - клетки меристематического типа овальной формы среднегоразмера 64 х 74 мкм, содержание в культуреоколо 704. Вторая группа представлена клетками паренхимного типа овальной формы, имеющих средние размеры 112 х 139 мкм, содержание в культуре около 25.Третья группа - клетки паренхимного типа 5 удлиненной формы среднего размера 64 х440 мкм, содержание в культуре около 50 .Максимум митотической активности наблюдается на 8 и 14-й день культивирования.Культура характеризуется анеупплои дией, увеличенным по сравнению с интактным растением количеством хромосом,Число хромосом о 28 12 28-38 7 15 42 2244- 54 32 56 18 Более 56 9 Культура не способна к морфогенезу.20 Получение препарата из биомассыштамма Аг, обладающего кардиотропным действием, После окончания цикла культивирования биомассу штамма Аг извлекают из культуральных сосудов и сушат в токе 25 горячего воздуха(50 - 60 С) в течение суток.Готовят настойку в.соотношении 1; 10 на 24,-ном этиловом спирте, используя метод перколяции в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи СССР Х из дании. Для Этого 100 г измельченного сырьясмачивают в отдельном закрытом сосуде достаточнь 1 м количеством зкстрагента. Через 4 ч набухший материал плотно укладь.веют в стеклянный перколятор и при открытом 35 спускном кране добавляют такое количество экстрагента, чтобы слой его над поверхностью составил 2 - 3 мм. Вытекающую иэ крана жидкость наливают обратно в перколятор, закрывают кран и оставляют на 24 40 ч, Затем медленно перколируют, спускаяза 1 ч обьем жидкости, соответствующий примерно 1/48 используемого объема перколятора. Перколяцию ведут до получения 1 л настойки. Настойку отстаивают в течение 45 5 дней при 8 С, затем фильтруют.Полученный препарат обладает профилактическим антиангинальным, антигипоксическим, антиаритмическим и кардиопротекторным видами действия.50 П р и м е р, В колбы Эрленмейера обьемом 500 мл наливают по 100 мл питательной среды следующего состава, мг/л воды:КН 4 ИОЗ 400КЙОЗ 1900 55 КН 2 Р 04 170СаС 126 Н 20 665Мд 304 7 НгО 370НзВОз 6,2Мп 504 4 Н 20 22,30,5 10015 Оценка профилактического антиангинального действия. В опытах на бодрствующих кроликах самцах породы Шиншилла массой 2,5 - 3,0 кг изучают влияние настоек 50 биомассы штамма Аг и стеблей кирказона на порог возникновения ишемии миокарда, вызываемой сужением коронарной артерии. С этой целью за 2 - 3 сут до проведения эксперимента под нембутэловым наркозом 55 проводят имплантацию приспособления, позволяющего осуществить медленную окклюзию коронарной артерии с последующим восстановлением ее просвета. Порог Сц 304 5 НгО 0,025 СоОг 2 НгО 0,025 Еп 304 7 НгО 8,6 йагМо 04 2 НгО 0,25 К 083. 5 Ее 304 7 НгО 27,8 йагЕОТА 2 НгО 37,3 Тиамина гидрохлоридПиродоксинэ гидрохлоридНикотиновая кислотаМезо-инозитЦистеина гидрохлорид 5 Казеина гидролизат 50 Сахароза 25000 рН среды 5,6 Колбы со средой стерилизуют при 20 117 ОС в течение 20 мин, затем в эсептических условиях в каждую колбу помещают по 4 г клеточной биомассы штамма Аг. Колбы устанавливают на качалку орбитного типа и встряхивают со скоростью 100 об/мин при 25 амплитуде 25 мм. Культивирование проводят в темноте при 25 С и относительной влажности воздуха 70; в течение 14 сут. Затем биомассу отфильтровывают и взвешивают, В каждой колбе накапливается от 30 - 20 до 25 г сырой биомассы. Биомассу сушат при 55 С в токе горячего воздуха в течение суток, измельчают и затем готовят настойку . 1:10 на 24;4-ном этиловом спирте методом перколяции в соответствии с требованиями 35 Государственной Фармакопеи СССР Х изд,Далее сравнивают фармакологическое действие полученного препарата с действием настойки иэ стеблей (лианы) кирказона, полученной параллельно тем же способом, 40 Во всех опытах настойки вводят лабораторным животным внутривенно в дозе 0,5 мл/кг веса. В контроле вводят соответствующее количество 24 этилового спирта. 45 ишемии миокарда определяют по степени сужения коронарной артерии, при которой появлялись признаки ишемии на прекардиальной электрокардиограмме. Из данных, представленных в табл.1, видно, что настойка стеблей кирказона маньчжурского и настойка биомассы штамма Аг оказывают профилактическое антиангинэльное действие во всех опытах, т.е, были эффективны в 100 случаев, По степени повышения порога ишемии миокарда обе настойки достоверно не отличаются друг от друга,Сравнительная оценка антиангинальной активности препаратов из стеблей и биомассы штамма Аг кирказона маньчжурского приведена в табл.3,Исследование антигипоксической активности. Изучают влияние препаратов из стеблей к; рказона маньчжурского и биомассы штамма Аг на длительность сохранения биопотенциалов миокарда при острой асфиксии у мышей.С этой целью мышей массой 18 - 20 г наркотизировали этаминэлом натрия (40 мг/кг внутрибрюшинно), выделяя трахею и подводили под нее лигатуру. Сразу после перевязки трахеи внутривенно вводят испытуемый препарат. Время сохранения биопотенциалов миокарда фиксируют, снимая ЭКГ во И стандартном отведении при визуальном контроле с помощью кардиоскопа, Из табл,2 видно, что препараты иэ стеблей и биомассы штамма Аг кирказона маньчжурского примерно в два раза увеличивают длительность сохранения биоэлектрической активности по сравнению с контролем, т.е. обладают выраженной антигипоксической активностью,Изучение антиаритмического и кардио- протекторного действия, Кардиопротекторное действие оценивают по влиянию препаратов на процесс формирования зоны некроза в остром периоде инфаркта миокарда у крыс, а также по течению ранних постокклюзионных аритмий, Опыты проводят на нелинейных крысах самцах массой 250 - 300 г, наркотизированных этаминалом натрия (40 мг/кг внутрибрюшинно), У живо.- тных, переведенных на управляемое дыхание, моделируют инфаркт миокарда перевязкой нисходящей ветви левой коронарной артерии на уровне нижнего края ушка предсердия.В течение первого часа после окклюзии коронарной артерии осуществляют визуальный контроль за состоянием сердечного ритма при помощи кардиоскопа, при необходимости записывая ЗКГ во И стандартном отведении, Размеры зоны некроза и зоныТаблица 1 Количество опытов Из них с наличием анти ангинального эффекта Из них с пыо его отсут-ствием анти ангинального эффекта Контрльт"лильнос а Конт Конт Нас Нас аствор вернь пр ишемии определяют через 4 ч после окклюэии коронарной артерии при помощи дифференциального индикаторного метода, После определения размеров зон повреждения рассчитывают процентное отношение зоны некроза к зоне ишемии в каждом опыте.Результаты представлены в табл,З, Препараты из стеблей биомассы штамма Аг кирказона маньчжурского обладают про 1 ивоаритмичбсг им действием при ран них постоккгнозиональных аритмиях. Настойка стеблей кирказона маньчжурского уменьшает частоту развития ранних постокклю.ионных аритмий с 72 , (в контроле) до 334, а настойка биомассы штамма А 2 - до 27 , Под влиянием настоек увеличивается длительность латентного периода и одновременно примерно в 4 раза ум пытается продолжительность аритмии,Оба препарата существенно уменьша. От размеры эоны некроза после ьоспроизведения инфаркта миокарда у крыс. Зонь некроза составляют соответственно 41 и оль (физиологический роль (з днол, 24 " р-р)и ив с теч , и 1 г,р к г; х 1щйка биомас ы шт-мм= Йр Различия с контролем досв серии 10. 40 ф для настоек стеблей лианы и биомассыштамма А 2 от зоны ишемии против 68 вконтроле.Таким образом, препараты из стеблей5 лианы кирказона маньчжурского и иэбиомассы клеточного штамма А кирказонаманьчуржского обладают профилактическим антиангинальным, антигипоксическим,противоаритмическим и кардиопротектор 10 ным действием,Эффективность препарата из биомассыштамма А 2 не уступает эффективности препарата из интактного растения,Полученные результаты свидетельству 15 ют о перспективности использования штамма А 2 кирказона маньчжурского какисточника препарата, обладающего кардиотропной активностью,Формула изобретения20 Штамм культивируемых клеток растений Агио 1 ос 6 а гпапзЬцгепзз Кое.ВСКК(ВР) М 37, используемый для получения препарата, обладающего кардиотропной активностью,25 0,05, количество животнь10 1708836 Таблица 3 Характеристика нарушений сердечного итмаДлительность Длительность латентного аритмии,периода, мин мин172 м 3 3,9,3 3,5+1,5" 7 5 й 2,5 33 12 3 ж 7, 4 О-ф,6" Продолжение табл.3," Различия с контролем достоверны Р0,05. Количество животных в контрольной серии опытов 17, в опытных сериях 10 - 12. Редактор А,Долинич Заказ 403 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб.; 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 КонтрольНастойкакирказонаманьчжурскогоНастойка биомассы штамма А 2 Частота развития ранних постокклюзионных аритмий,Составитель В.БулгаковТехред М,Моргентал Корректор М,Максимишинец