Способ получения днк для диагностики н -а, н -в гепатита — SU 1711676 (original) (raw)
)5 С 12 й 15/10, 15/5 ОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК П ТУ АТЕН(53) 575.224.2; 577.2/048(088,8)ф 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДНК ДЛЯ ДИАГ-НОСТИКИ Нц-А, НцрВ-ГЕПАТИТА(57) Изобретение относится к медицине иможет быть применено для диагностики заболевания Нц-А, Нц-В-гепатита, Способполучения ДНК для диагностики Нц-А- НцВ-гепатита заключается в том, что осущестИзобретение относится к медицине иможет быть применено для диагностики за-.болевания Нц-АНц-В-гепатита,Предложен способ получения ДНК, предусматривающий предварительную стерилизацию суспензии кала путем фильтрацииее через миллипоровый фильтр размеромоколо 0,22, осаждение полиэтиленгликолем,(ПЭГ 6000) при конечной концентрации10, отделение осадка, растворение его вбуфере, встряхивание с фреоном в соотношении 1:1, отделение фреоновой фазы,осаждение ПЭГ 6000 при конечной концентрации 10;(у, обработку РНК-азой и:ДНК азой, фракционирование в градиентехлористого цезия, отделение фракциисплотностью 1,3 г/мл, диализ, обработку пол;.ученной фракции протеиназой К, экстра- .кцию 80;(у-ным фенолом и хлороформом,вляют стерилизацию суспензии кала путем фильтрации ее через миллипоровый фильтр размером около 0,22 мкм осаждают полизтиленгликолем 6000 при конечной концентрации 100/б, отделяют осадок, растворяют его в буфере, встряхивают с фреоном в соотношении 1;1, отделяют фреоновую фазу, осаждают ПЭГ 6000 при конечной концентрации 10%, обрабатывают РНК- и ДНК- азой, фрак ционируют в градиенте хлористого цезия, отделяют фракции с плотностью 1,3 г/мл, диализуют, обрабатывают полученную фракцию протинозой К, экстрагируют 800/р-ным фенолом и хлороформом, обрабатывают ДНК рестриктазой Есойе клонируют фрагмент ДНК в плазмиде рйй 322 или в лямбда-фагах. обработку ДНК рестриктазой Есо К 1, клонирование фрагмента ДНК в плазмиде рВ 8322 или в лямбдах-фагах.П р и м е р 1. Выделение ассоциированного с Нц-А Нц-В-гепатитом вещества из кала пациентов.(сИспользуемый буфер: трис-НО, рН 7,4, 0,05 Н. ВО ВСЕХ СтадИяХ рабст, Оцеа) Обработка, 0,5 г кала суспендируют в 10 ма буфера, центрифугируют при 8000 р и );и собирают надосадочную жидкость. Остаток промывают еще раз с помощью 10 мл и затем 5 мл буфера. Собранные надосадочные жидкости центрифугируют (30 мин, 10000 об/мин) и фильтруют через непроницаемый для бактерий фильтр (около 0.22 миллипор). Надосадочную жидкость осаждают с помощью ПЭГ 6000 (конечная концентрация 10, соответственно, 0,4моль/л), Спустя 2 - 12 ч осадок отделяют центрифугированием и растворяют в 10 мл буфера. Этот раствор встряхивают с 10 мл фреона, фазы разделяют путем центрифугирования, фреоновую фазу еще раз и ромывают 5 мл буфера. Повторяют осаждение с помощью ПЭГ и чаС (конечная концентрация 10, соответственно 0,4 моль/л), Осадок обрабатывают примерно 800 мкл буфера.Полученный раствор переваривают с РНК- и ОНК-азой в течение 1 ч при 37 С и наносят на градиенты хлористого цезия.б) В пробирки для центрифугирования вносят 1 мл раствора хлористого цезия с плотностью 1,4 г/мл и сверху в каждую по 3 мл раствора с плотностью 1,3, 1,25 и 1,2 г/мл, Все растворы готовят на укаэанном буфере. На градиенте наслаивают 800 мкл экстракта кала, центрифугируют 65 - 72 ч при 10 С (31000 об/мин). Затем собирают фракции нижней области градиента (плотность 1,4 - 1,4 г/мл) примерно по 200 мкл, в верхней области с плотностью 1,1-1,2 г/мл можно отбирать большие фракции. Плотность каждой фракции определяется путем измерения показателя преломления, Все фракции диализируют и по 50 мкл каждой фракции исследуют по МАчВ-анализу на ассоциированное с Нц-А, Но-В-гепатитом вещество. В положительных фракциях определяют концентрацию белка,Идентификация и характеристика вещества.в) Приготовление градиентных полос.Продиализированные и возможно сконцентрированные фракции градиента хлористого цезия смешивают с 10 мкл ЯОЯ, 10 мкл глицерина и 5 мкл бета-меркаптоэтанола, 5 мкл бромфелового синего на 100 мкл пробы и кипятят 3 мин на водяной. бане, Затем их смешивают с 5 мкл 0,1 о-ного раствора пиронина и наносят на градиентный полиакриламидный гель, Продолжительность 3,5 ч, напряжение 160 - 300 В, сила тока 40-25 А, мощность 20 Вт,Примерно за 5 мин до окончания электрофореза еще раз накосят,5 мкл пиронина и заканчивают операцию, как только пиронин пройдет через гель, Гель либо окрашивают с помощью серебра, либо осуществляют блоттинг в течение ночи при 0,5 А, затем 1 ч при 1 А.г) Блоттинг-анализ.По окончании блоттинга различные полосы (выделенные пирониновыми маркировками) вырезают и в сопровождении стандарта молекулярного веса окрашивают амидо-черным. Полосы с пробами встряхивают в течение 24 - 72 ч в 1-ном 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 растворе желатины в РВЯ, цй-фракция пациента, соответственно ЕаЬ-фрагментыэтой 90-фракции маркируют с помощьюиода(хлорвмин Т): 0,5 мкг на 100 мкгпротеина, При этом инкорпорируются примерно 70 активности. Радиоактивный индикатор, объем которого соответствуетпримерно 2 мкг протеина, разбавляют в 20мл желатины в РВЯ и затем полосы инкубируют при встряхивании в течение 12 ч. После этого полосы промывают по 1 ч 3 раза спомощью желатины-РВЯ, 2 раза с помощьюРВЯ-Твин 0,5 о-ный и 1 раз водой. Послевысушивания полос их накладывают на чувствительную рентгеновскую пленку и экспонируют при -70 С в течение 2 - 7 ми дней,П р и м е р 2. Метод обнаруженияассоциированного с НИАИВ вещества в кале,Полистирольные шарики вместе с сывороткой выздоровевших пациентов, болевших Нц-А, Но-В-гепатитом, в разбавлении1:200 в карбонатном буфере, рН 9,2, 0,01моль/л, инкубируют 12 ч при комнатнойтемпературе, шарики промывают забуфе-.ренным фосфатом физиологическим раствором хлорида натрия (РВЯ). Пробы кала вформе 10 О-ной суспензии кала инкубируют2 ч при 37 С с покрытыми, как указано, шариками из полистирола, после чего обильнопромывают с помощью РВЯ, который содержит 0,5;4 Таина, и затем инкубируют при37 С в течение 1 ч с человеческим 90 изсыворотки выздоровевших от Но-А- Нц-Вгепатита, которая маркирована иодом,После промывки дистиллированной водойсвязанную с шариками радиоактивностьподсчитывают на гамма-счетчике. Пробы кала, в которых связанная радиоактивностьдостигает трехкратного значения отрицательного контроля, считают положительными на наличие ассоциированного с Нц-А,Н ц-В-гепатитом вещества.Установлено, что положительную реакцию обнаруживают в пациентов с Нц-А, НцВ-гепатитом, что применение этого анализау большого числа пациентов с массой совершенно различных заболеваний печени, которые, не имеют ничего общего с Нц-А,Нц-В-гепатитом, вещество, если вообще находят его, находят только в очень низкомпроцентом содержании,Во время исследования коллективов пациентов с гепатитом другого генеза либогепатитом А, либо гепатитом В, ассоциированное с Но-А, Нц-В-гепатитом веществонаходят в очень низком процентном содержании.Установлено, что пациенты с Нц-А, НоВ-гепатитом имеют 30 фь положительных результатов, в противоположность чему в случае подозрения на гепатит А, гепатит В ипостгепатит В у пациентов это число значительно ниже,П р и м е р 3, Выделение ДНК,из кала 5и клонирование ДН К-последовательностей.. Из кала пациентов с Но-А, Нц-В-гепатитом, как описано в примере 1, выделяютассоциированные с Нв-А, Ни-В-гепатитомчастицы, как там описано, обрабатывают и 10очищают через градиенты хлорида цезия идиализуют. Диализованные фракции исследуют.на наличие ассоциированного с МАИВвещества описанным образом. Фракциюплотности 1,3 г/мл в градиентах хлорида -15цезия переваривают с 50 мкг протеиназы К,10 ЯОЯ и ЭДТА в конечной концентрации10 мМ в течение 6 ч при 37 С, Протеиныудаляют путем экстракции с помощью 80 ного фенола (вес/объем) и хлороформа, и 20после этого растворенную в водной фазеДНК в присутствии 0,3 М ацетата натрияосаждают с помощью двух с половинойкратного объема этанола в течение 60 ч при-70 С. Затем центрифугируют иосадок промывают один раз с помощью 70 ф-ного этанола, высушивают и после этогообрабатывают ТЕ-буфером, состоящим из.10 ммоль/л Трис, рН 3, и 1 мМ ЭДТА, вобъемном соотношении 1 мкл/5 мг обработанного кала.15 мкл этого основного раствора ДНКинкубируют в течение 1 ч при комнатнойтемпературе в общем реакционном объеме50 мкл с 6 единицами полимеразы Кленова 35(ДНК-полимераза 1, большой фрагмент), 1мкл раствора бАТР, бТТР и ббТР, в концентрации 1 мМ, а также 5 мкл альфаР-бСТР .в инкубационном буфере для полимеразыКленова по данным изготовителя, 40После этого добавляют 2,5 мкл 1 мМ.бСТР-раствора, инкубируют 1 ч при комнатной температуре, прогревают при 68 С втечение 10 мин и охлаждают до 00 С, Затемреакционную смесь вместе с 2 единицами 45Т 4-ДНК-лигазы, 1 мкг фосфорилированногоЕсоР-линкера и 6 мкл 10 мМ раствора бАТР.инкубируют в течение 16 ч при 16"С. В:реакционной смеси затем устанавливают конечную концентрацию 150 мМ йаС и 50вместе с 240 единицами ЕсоР-рестрикционной эндонуклеазы (80 ед,/мкл) переваривают 3 ч при 37 С. Реакцию прекращаютдобавлением 5 мкл 800-ного фенола и 1 мкл20-ного ЯОЯ, Радиоактивно микрирован 55ную и снабженную линкерами ДНК отделя.ют от соли и нелегированных линкеровчерез колонку с сефарозой (объем колонки3 мл, длина 25 см) и осаждают 2,5-кратнымобъемом этанола в течение 16 ч приС.Ф)" Осажденную ДНК центрифугируют 10 мин при 14000 д, осадок промывают 150 мкл 704-ного этанола, высушивают и обрабатывают 10 мкл ТЕ-буфера.П р и м е р 4. Клонирование изолированной ДНК в лямбда-фаги и трансфекция на бактерии.Для лигирования с ДНК-вектором 2 мкг ДНК лямбда-фагов 1149 вместе с 2-мя единицами ЕсоР(4 ед./мкл) в общем реакционном объеме 6 мкл/инкубационный буфер по данным изготовителя) инкубируют 1 ч при 37 С. Затем фермент инактивируют путем 10-минутного нагревания при 68 С. Этот раствор лигируют с 3 мкл маркированной ДНК, которая выделена как описано в примере 3, 1 мкл 5 мМ АТР и 1 ед. Т 4-ДНК- лигазы при комнатной температуре, 4 мкл этой реакционной смеси упаковывают в оболочки лямбда-фагов. Этими упакованными фагами инфицируют штамм ЕзспегсЫа со 1 ММ 514, Для скрининга на наличие встроенной ДНК примерно 10 фагов наносят на пластины для скрининга размером 22 х 22 см и инкубируют в течение ночи при 37 С. ДН К-фаги переносят на фильтр из нитроцеллюлозы путем отпечатка, фильтр гибридизируют с 1 мкл описанного радиоактивного основного раствора ДНК, промывают и ауторадиографируют 6 ч при -70 С,Из 70 положительных сигналов гибридизации выбирают 17 подчиненных колоний фагов при плотности примерно 5 тромбоцитов на 1 см, После очистки.тромбоцитов готовят 16 положительных клонов, которые содержат ДНК-вставки длиной от 0,3 т.п,о. до примерно 1,5 т.п,о и гибридизируют с пробой первоначального основного раствора ДНК.П р и м е р 5. Характеристика ДНК- фрагмента длиной 0,45 т,п.о и субклонирование этого фрагмента в плазмиду рЧС 19 в ЕзсйегсЫа соИ,ДНК-фрагмент удаляют из ДНК фагов путем переваривания эндонуклеазой ЕсоР 1 при описанных условиях. Фрагмент отделяют на агарозо-геле от ДН К лямбда-фагов, и геля вырезают соответствующие вставке ДНК-полосы и элюируют. Изолированную ДНК-вставку вносят путем лигирования в ДНК-вектор рЧС 19 и после этого трансфицируют в штамм Н 1 ЕзспегсЫа соП. После селекции штаммов бактерий осуществляют выращивание наработку штамма.Вставку радиоактивно маркируют и ис-. пытывают путем анализа по Соузерну на гибридизацию с исходным материалом, экстракциями из калов контрольных лиц; вирусом гепатита и плазмидой РВР 322.П р и м е р 6. Обнаружение ассоциированной с Нц-А, Нц-В-ДНК в сыворотке.2 - 5 мл сыворотки центрифугируют при150000 д в течение 2 ч,Осадок переваривают при 37 С в течение 1 ч в 200 мкл растворапротеиназы К (0,5 мг/мл, 10 мМ ЭДТА), краствору добавляют 165 мкл горячего насыщенного раствора иодида натрия (2,5 гиодида натрия/мл Н 20, 75 С) до конечнойконцентрации 12,5 М, нагревают 10 мин при90 С и фильтруют непосредственно черезнитроцеллюлозный фильтр под вакуумом,После фильтрации нитроцеллюлозную.пленку промывают 3 раза 70(у-ным этано;. лом и затем 10 мин при комнатной темпера.туре инкубируют в 100 мл уксусногоангидрида (100 мл, 0,1 М тризтаноламина,250 мкл уксусного ангидрида). После инкубации пленку обжигают в вакууме при 80 С, в течение 1-2 ч. Высушенную пленку вносятв раствор предварительной гибридизации,инкубируют 3 ч при 65 С (6 хЯЯС), 1 хОеМагбт, 0,5 фу ЯОЯ, где 20 х ЯЯС (стандартный солевой цитрат) соответствует ЗММЭС 1, 1,5 М цитрат натрия.ЯОЯ - додецилсульфат натрия.100 х Оепйагбг - раствор соответствует. 2 Рсо, 27 у поливинилпирролидона, 2бычьего сывороточного альбумина), 20мкг/мл денатурированной нагреваниемДНК спермы), инкубируют с 32 Р-маркированной пробой в течение ночи в условияхпрегибридизации. Затем нитроцеллюлозную пленку промывают 3 раза в растворе (1:бхЯЯс, 1 хОеп 1 агб, 0,5/ ЯОЯ, 20 мкг/млДНК-спермы, 1 хЯЯС, 0,5; ЯОЯ, 1 хОепЬзгб 1, 0,1 х ЯЯС+ 0,05(у ЯОЯ). Послевысушивания пленки ее накладывают нарентгеновскую пленку на время от 6 ч до 2дней при 70 С,П р и м е р 7, Обнаружение Нц-А, НцВ-ДНК в сыворотке.200 мкл сыворотки инкубируют с 75 мклраствора протеиназы К(4 мгlмл) и 25 мкл 0,5М ЭДТА при 37 С в течение 1 ч, затем добавляют 100 мкл 1 н. МаОН, выдерживают10 мин при комнатной температуре и нейтрализуют 250 мкл 2 М ацетата аммония. 500мкл смеси (соответственно 181 мкл сыворотки) наносят на нитроцеллюлозу, нейтрализуют 250 мкл 2 М ацетата аммония, сушат ввакууме.при 80 С в течение 45 мин. Фильтры перегибридизируют в 6 х ЯЯС, 0,5; ЯОЯ,1 х растворе Репйагбт и 20 мкл/мл денатурированной (5 мин, 100 С) ДН К спермы при65 С в течение 3 ч,.Для гибридизации, которую осуществ.ляют в течение наци в условиях прегибридизации, ис пол ьзуют ма ркирова н ную спомощью 32 Р за счетЮсК-трансляции10 мкл 0,5 М ЭДТА инкубируют 30 мин при20 37 С, Затем раствор разбавляют с помощью 30 35 40 45 50 55 вставку фвговык клонов удвльнвя вктнвность примерно 1 - 2 х 10 срв (мкг ДНК).Фильтры затем, смотря по обстоятельствам,промывают еще раз 20 мин при 65 С с помощью 6 х ЯЯС, 1 х раствором ОепЬагй,0,5; ЯОЯ,.20 мкгмл денатурированной ДНК Негпд-спермы, затем 1 х ЯЯС, 0,5 ЯОЯ, 1 х- раствора ОепЬагбс и 0,1 х ЯЯС, 0,05 ф ЯОЯ и высушивают при 80 С. Аутора-. диографию осуществляют с помощью рентгеновской пленки и усилительной пленки при времени ауторадиографии 6 - 48 ч при -70 С.П р и м е р 8. Подготовка проб для анализа.1 мл сыворотки с 350 мкл раствора протеиназы К (3 мгlмл протеиназы К, 10 мМ Трис, рН 7,5, 0,5 мМ ЭДТА, 0,5; ЯОЯ) и 125 8 мл 2 М ТСА (рН 7,0), 3,2 мл 2 М ацетата аммония, 20 мкл РНК(10 мг/мл) и 5,3 мл Н 20 до 16 мл. ДНК осаждают 10 мл изопропанола при комнатной температуре в течение 30 мин. Осадок ДНК отделяют центрифугированием (15 минут при 8000 об/мин) промывают его 2 мл 70;-ного этанола, растворяютв 600 мкл 10 мМ Трис, рН 8,4, и 1 мМ ЭДТА,экстрагируют 1 раз фенолом, 1 раз хлороформом и еще раз осаждают, Аликвотныечасти осажденной ДН К используют для Росблоттинг-анализа или для рестрикционногоанализа,Получение ассоциированной с частицами ДНК из проб кала осуществляют такимже образом. Суспензии кала предварительно стерильно фильтруют и осаждают с помощью ПЭГ,П риме р 9. Если имеется относительно мало ассоциированного с Нц-А, Нц-В вещества, то оказывается целесообразнымобнаружить ДНК путем амплификации,Обнаружение Нц-А, Нц-В-ДНК в сыворотке осуществляют путем гибридизации срадиоактивно маркированной клонированной Нц-А, Нц-В-ДНК-пробы после предва-рительной специфической ферментативнойДН К-амплификации.25 мкл сыворотки, 50 мкл йа (насыщенный раствор) смешивают, инкубируют 2 минпри 37 С, после чего инкубируют 10 мин при0 С. Инкубат диализуют на поликарбонатной мембране против ТЕ-буфера (10 мМТрис, 1 мМ ЭДТА) 20 мин. 5 мкл диализатаотбирают для сПецифической ферментатив"ной ДНК-ампдификации с помощью по 0,5мкг олигопраймера (пара А и В,.соответственно, С и О). Олигопраймерные пары готовят по известным данным секвенированияпосредством ДНК-синтезатора. После амп10 Формула изобретения Способ получения ДНК для диагностики Нц-А, Нц-В-гепатита, заключающийся в предварительной стерилизации суспензии кала путем фильтрации ее через миллипоровый фильтр размером пор 0,22 мкм осаждении полиэтиленгликолем 6000 при конечной концентрации 10%, отделении осадка, растворении его в буфере, встряхивании с фреоном в соотношении 1:1, отделении фреоновой фазы, осаждении полиэтиленгликолем 6000 при конечной концентрации 10%, обработке РНК- и ДНК-азой, фракционировании в градиенте хлористого цезия, отделении фракции с плотностью 1,3 г/мл, диалиэе, обработке полученной фракции протеиназой К, экстракции 80 О-ным фенолом и хлороформом, обработке ДНКрестриктазой Есо й 1, клонировании фрагмента ДНК в плазмиде рВй 322 или в лямбда-фагах. Составитель Т.Забойкина Редактор С,Патрушева Техред М,Моргентал Корректор В.ГирнякЗаказ 351 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 лификации реакционную смесь разделяютэлектрофоретически на 2-ном агароэномгеле, наносят на нейлоновую мембрану и .гибридиэуют с маркированной с помощьюзР, клонированной Нц-А, Нц-В-ДНК-пробы." После ауторадиографии идентифицируют положительные результаты,.руководствуясь стандартом и маркерами. Сопровождающие контроли служат для оценкйэффективности, амплификации, как с помощью НВЧ-специфических праймеров, таки также с помощью специфических к Нц-А,Нц-В-праймеров. Доказательство идентичности находящейся в инфекционной загрузке ДНК с ДНК иэ кала пациентов с Нц-А, 15Нц-В-гепатитом говорит об идентификациивключенной в Нц-А, Нц-В-гепатит ДНК.Исследование дальнейших 57 проб капапациентов со спорадическим и пост-гемотрансфузионным Нц-А, Нц-В с помощью радиоиммуноанализа, как описано впредыдущих примерах, и в Оот-блоттингс-пособе, дает замечательную корреляциюобоих способов исследования,в отношенииобнаруживаемого, ассоциированного с НцА, Нц-В-вещества (В 1 А) и обнаруживаемойДНК (Рот-блоттинг, см, пример 7),ДНК показывает родство с НВЧ-ДНК.Если клонированный 0,45 кВ Фрагмент илиочищенный материал кала маркирован Р 30и гибридизован,в анализе по Соузерну до.,НВЧ-ДНК, обе пробы дают сигнал, правда,примерно в 1000 раз слабее, чем сам посебе. Плазмида рВЯ 322 и лямбда-фагй недают никакого сигнала. В предварительных 35опытах очищенную пробу кала, без осуществления денатурации, можно очень хорошомаркировать маленьким фрагментом Е соП. полимераэы.Обработанная полимераэой Кленова 40проба кала мигрирует в геле агарозы отчетливо медленно, чем необработанная проба.Это говорит о том, что исследованная ДНК,также как НВЧ-ДНК, частично двунитевая.Результаты и обработка рестрикционными 45ферментами и экстрензйя праймера дока- .зывают циркулярную структуру ДНК. Полученные ДНК,. в особенности находящиеся в этих ДНК гены, можно использовать для включения в соответствующие векторы экспрессии, как клетки и бактерии (например Е.со и дрожжи, как Яасспагогпусез сегенэае, а также культуры клеток) и для получения вирусных антигенов. Таким образом возможна диагностика и получение иммунореагентов и вакцин, В случае диагностики нужно назвать в особенности исследование на инфекцион ность (исследование консервированной крови) и диагноз острой, хронической или по времени прошедшей инфекции. Приготовленные в культурах клеток антигены, а также соответствующие, синтезированные благодаря этим вирус-ДНК ин виво и ин витра протеины можно использовать для установления иммунологической диагностики. ДНК-последовательность может применяться для идентификации потенциальных вирусных протеинов (белков) и их синтетического получения, следовательно, получения синтетических антигенных пептидов,