Способ получения биомассы — SU 444375 (original) (raw)
ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ ггп 444375 Санга Советских Социалистических(33) СШАОпубликовано 25.09,74. Бюллетень М 35 Государственный комитет Совета Министров СССР по делам изобретенийи открытий(53) УДК 663.14(088.8) Дата опубликования описания 25.09.75(США) Иностранная фирма Нотерн Иллиноис Газ Компани(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ Изобретение относится к микробиологии.Известен способ получения биомассы путем выращивания микроорганизмов в водной питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в присутствии минеральных солей при аэрации кислородсодержащим и углеводородсодержащим газами, регулировании общего парциального давления кислорода и общего давления в питательной среде с последующим отделением микроорганизмов от питательной среды.Цель изобретения - улучшение условий выращивания.Это достигается тем, что регулирование давления кислородсодержащего газа и углеводородсодержащего газа в водной питательной среде осуществляют так, что оно обеспечивает весовое отношение растворенного кислорода к растворенному углероду в среде до 5-кратного тто сравнению со стехиометрическим весовым отношением потребленного кислорода к потребленпому углероду при ооразовании биомассы, при этом производят одновременное регулирование общего давления газа и общего парциального давления кислорода, чтобы в среде было менее чем 30 ч/млн общего растворенного кислорода. Для проведения описываемого процесса выбранный микроорганизм, использующий углеИностранцы.,.,"; 1 Иласс и Джеймз Дэвид Краус водород, или смесь микроорганизмов и водная питательная среда загружаются в бродильный чан, приспособленный для поддержания давления выше атмосферного. Особенно полезны 5 микроорганизмы, использующие метан родаВасйиз, Рзеийотогаз и Мейатотогаз, в особенности микроорганизм рода Рьеиг/опогав АТСС, 310, который в выделенном сухом состоянии является полезным как пища или 10 корм или кормовая добавка. Водная питательная среда содержит наряду с водой питательные минеральные соли, включая ион аммония или нитрата, как источник азота и имеет рН около 7,0.15 Брожение проводится при комнатной температуре путем подачи в бродильный чан углеводородной текучей среды и воздуха или другого кислородсодержащего газа таким образом, что сумма парциальных давлений в угле водородном питании обеспечивает весовое отношение растворенного кислорода к растворенному углероду в бродильной среде примерно до 5-кратного по сравнению со стехиометрическим весовым отношением потребленного 25 кислорода к потребленному углероду при образовании биомассы, и обгцее давление кислородсодержащих газов подачи и парциальные давления кислорода аналогично регулируются так, чтобьг в среде обеспечивалось от 0,0001 до Зо 0,0090 всего растворенного кислорода.Количество, г Соль МаХОзМд 804. 7 Н,ОК 2 НР 04Са 804Ге 504 7 НО11 аНР 04Со (ХОз)6 НгОМп 804 1,00,10,0450,010,0010,00020,00020,00020,00004 Полученная биомасса отделяется от остающеися жидкости, промывается и может использоваться или может быть высушена и затем использована как пищевой продукт или дооавка к нему,Используемый микроорганизм Рвеис 1 отоиаз теЯапка КУК (А 1 СС, 310), использующии углеводороды, может быть описан как состоящий в молодых культурах из оольших грамнегативных палочек шириной 1 - 3 мк и длиной 4 - 8 мк, По составу орутто клеточные продукты по весу содержат оо - 70, оелка, 20 - 40% углеводородов, 2 - 0 ", жира и 2 - 6% золы, Организм может быть культивирован и выделен из различных сред минеральных солеи.1 редпочгнтельным источником азота является ион аммония или из аммиачн 4 ях солей, или из аммиака, но могут применяться другие источники азота (за исключением элементарного азота), например нитраты. Субстратом может оыть метан или природный газ различного состава и кислород или воздух с углекислотой или без нее. Микроорганизм Рвеийотоиаз (Л 1 СС, 310) будет расти в присутствии метана или метанола и может использовать некоторые высшие у глеводороды, например гексан, когда растет в метане. Метан должен присутствовать в пределах от 1 до 97 об, %, кислород может подаваться в широком пределе концентрации вне токсичных количеств в газе питания. Ион магния является важным ионом (предпочтительно от 0,005 до 0,35 г/л иона магния). Ион кальция в виде растворимых солей должен присутствовать в среде в концентрации пе менее 0,00025 г/л. Ион железа в виде растворимых солей должен присутствовать в среде в концентрации не менее 0,0001 г/л, Микроорганизм Рзеисотогаз (А 1 СС, 310) может использовать различные неорганические источники азота предпочтительно с ионом аммония в концентрации от 0,1 до 5,0 г/л. Скорость роста микроорганизма Рзеииотопаз почти нулевая при 0 С и при 40"С, умеренная при 25 С и оптимальная при 30 - ЗЬ С. Время удвоения организма зависит от условий роста, например, непрерывности потока или статического состояния газа питания во взбалтываемых сосудах или в непрерывных системах брожения, где лимитирующие факторы не присутствуют и время поэтому изменяется от 5 до 100 час.Микроорганизм АТСС, 385 является смешанной культурой, выделенной из почвы или растения элодиа и определенной среды минеральных солей и атмосферы, содержагцей метан, кислород, углекислоту и азот. Этот микроорганизм содержит грам-отрицательные палочки шириной 0,5 - 3,0 мк и длиной 2 - 10 мк в качестве преобладающего организма, малую бактерию и дрожжевые клетки.Большая часть организмов подвижна и несколько неустойчиво окрашивается по Граму, но обычно они умеренно грам-отрицательны, АТСС, 385 растет только в присутствии метана, но при росте в метане может использо 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 бО 55 вать высшие углеводороды. Кислород в газе питания может подаваться с высокой концентрацией. Углекислота не существенна для роста, но является предпочтительным компонентом гааз питания. АТСС,385 может использовать различные неорганические источники азота, Рост происходит в температурном пределе от 10 до 55 С и при рН от 5,0 до 8,0. Оптимальный рост при 20 - 37 С и рН от 6,5 - 7,5,,Цля выделения культуры пользуются стан дартным методом, но применяют питательную среду из минеральных солей, почти свободную от меди и цинка, за исключением малых количеств в виде загрязнений в других солях,Типичная соленая среда (2/500 мл) для выделения; Выделение культуры происходит следующим образом. В каждую из нескольких стерильных 250 мл колб Эрленмейера вносят 50 мл стерильной среды из основных солей, описанных в табл. 1, почти не содержащих меди и цинка. В среду каждой из нескольких колб затем добавляют малыми порциями, например 0,5 г, образцы растения элодия. В несколько дополнительных колб добавляют 0,5 - 1,0 образцов почвы. Почву можно брать из любого места, о почвы городских предместей предпочтительнее, так как воздух в таких районах загрязнен метаном и культура получается легче. Содержимое колб перемешивают и насыщают газовой смесью, содержащей метан. После плотного закупоривания колбы инкубируют при 30 - 35 С и время от времени встряхивают. Газовая смесь обновляется через каждые две недели. Признаки роста культуры появляются через 3 - 6 недель, когда растущую культуру переносят в новую среду.Подготавливают новый комплект стериль. ных колб, содержащих по 50 мл стерильной среды. Исходные колбы, содержащие растущую культуру, хорошо встряхивают и из каждой колбы 2 мл суспензии переносят в новую колбу. После перемешивания новые колбы инкубируют при 30 - 35 С после насыщения стандартной газовой смесью, Как и прежде колбы периодически встряхивают и снова газируют через некоторые промежутки, примерно через 2 - 4 недели. В это время растущую культуру переносят во взбалтываемую колбу и в чашку с агаром. Для этого приготавливают агаровые чашки со стандартной основной средой и заражают элодией илп почвенными микроорга444375 низмами по обычному бактериологическому методу.Эти чашки ставят непокрытыми в газоплотный эксикатор с возобновляемой атмосферой. Через 2 - 4 недели появляются ослыс нлн ркелтоватые колонии. Одну или несколько таких колоний перевочят во встряхнвасмую колб,. Растущую культуру применяют для заракения питательной среды для роста клеточногоматериала. П р и м е р 1. Усиление роста Рзаас 3 отопая 5 тейаирса (АТСС, 310) прн различных питательных газах и увс,чпчснных давлениях показывается путем сравнительных результатов, приводимых в табл. 1. Условия ферментацни:Таблица 1 Оптическая плотность при 420 нм при ереиени бреиеенин, нееОбъемное отношение СН 4. О,И,Культура 65 109 46 0,10 Только воздух 0,09 8,6 0,09 0,09 80:20:080:20:038:62:040:40:2097:3:093,4:6,6:080:20:026,1:6,6:67,326:74:040:40:20 8910 0,11 0,15 Склянки емкостью 200 мл пол давлением ( 23187 фирмы 1 ц 1 оп Гласс К), 100 мл среды 377 (см. Гирш и Конти Лгс)ч, ЮсгоЫОод 48,339 - 57, 1964), 1,0 мл посева для индукционного периода, ручная мешалка, комнатная температура, указанные статические,чавления, выполняемые через 0,22, 46 и 65 час. Через 65 час ферментации в культурах 4 и 9,чавление О.Из таблицы видно, что, когда концентрация растворенного кислорода менее 30 чтмлн незавпсимо от давления питательного газа и от ношение растворенного кислорода и углеролуприблизительно соответствует отношеншо потреблснного кислорода к углероду, то скорость роста организма п клеточная плотность наивысшие. 15П р и м е р 2. Эффект концентрации кислорола на рост ЛТСС, 385 при различных давлениях в склянках показывается сравнительными результатами, приведенными в табл. 2. Таблица 2 Время ферментацнп, час Растворено, ч/млн Давление питательного газа, ,",фунт/дюйм Куль 240 311 75 95 120 50 119 46 148 СН,: СО,тура 0,22 0,22 0,45 0,45 0,42 0,12 0,14 0,17 0,18 0,17 0,8 0,29 0,07 0,70 0,66 0,670,612,72,72,70,672,72,75,45,4 0,29 0,93 0,92 1,85 2,00 0,27 0,86 0,85 1,70 1,65 0,24 0,70 0,72 1,38 1,40 0,16 0,48 0,48 0,90 1,05 0,14 0,42 0,45 0,83 0,84 0,06 0,16 0,16 0,28 0,27 Контрольная1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 8 9 10 4,0 4,0 4,0 4,0 32,1 42,0 42,0 42,0 42,0 42,0 0 0 45,0 45 0 45,00 45,0 45,0 105,0 105,0 7,4 7,4 30,1 30,1 30,1 7,4 30,1 30,1 60,4 60,4Условиями ферментации: склянки емкостььо 200 мл ( 23187 фирмы 1 ц 1 оп Гласс К),50 мл среды 691, стерилизованной автоклавированием, 2,0 мл посева для культур 1 - 5, 1,0 мл посева для культур 6 - 10, комнатная температура, механическая мешалка, статистическое давление питательного газа во время отбора образцов, питательный газ состава (в о/О): 35,5 СН 4, 0,42 СНб, 0,05 СН, 0,09 СО, 1,70 О 0;08 Аг, 62,2 И приготовленььый из сухого воздуха баллонов Матесона, технического метана и очищенного азота.Состав среды 691 (в г/л): 3,24 КНРО 4, 2,72 КНРО, 1,5 (ИН 4)НРО, 0,25 сЧдЯО,ь 7 НО;0,00001 СаС 1,; 0,001 РеЯОь 7 Н,О.П р и м е р 3. В перемешиваемом бродильном чане был проведен опыт ферментации с использованием посева Сапйда 1 уро 1 у 11 ся в дрожжевой азотистой базе (Дифко) с н. Додеканом в качестве углеродистого субстрата и воздухом. Углеродистый субстрат и воздух подавались в бродильный чан непрерывно и раздельно. Температура 30 С, начальное давление воздуха 4 фунт/дюйм (1 фунт/дюйм = =0,070307 кгс/см). Когда клеточная плотность достигла 1,0 г/л, давление воздуха было повышено до 15 фунт/дюйм, когда клеточная плотность достигла 5,0 г/л, давление воздуха было повышено до 50 фунт/дюйм и поддерживалось таким до конца.Другой вариант описываемого способа улучшает процесс микробного превращения углеводородов в белок клеток в новой непрерывной многоступенчатой системе ферментации. Растущая биомасса непрерывно подвергается различному давлению питательного газа в каждом бродильном чане, причем в первом чане подвергается самому низшему и в последнем чане самому высокому давлению, Газы, отходящие из чана, рециркулируются в один или несколько чанов, имеющих меньшую клеточную плотность.Описываемый способ поясняется чертежом.Среда, содержащая углеводороды и кислородсодержащий газ, по отдельности или смешанные непрерывно пропускаются через многоступенчатую систему ферментации, содержащую углеводороды, микроорганизмы и питательные вещества. В результате бродильный чан 1 подвергается самому низшему давлению питательного газа, в бродильном чане 2 давление увеличивается, а бродильный чан 3 подвергается самому высокому давлению, и сле довательно, система поддеоживается в постоянных условиях ферментации. Использование питательного газа и скорость производства клеточного белка одновременно максимально увеличиваются в результате удлиненного вре мени пребывания субстратов и постепенно увеличивающихся давлений у вытекающего потока, где клеточная плотность и требование на кислород и углерод наивысшие.Свежая или рециркулируемая питательная 15 среда, питательные газы и клетки могут рециркулироваться в различные чаны ряда и изменяться могут другие параметры, включая объем и геометрию чанов, число их и скорости пропускания свежей среды или жидких сред 20 в один или более чанов, состав жидкости и питательного газа.Предмет изобретения25Способ получения биомассы путем выращивания микроорганизмов в водной питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в присутствии минеральных солей при З 0 аэрации кислородсодержащим и углеводородсодержящим газами, регулировании общего парциального давления кислорода и общего давления в питательной среде с последующим отделением микроорганизмов от питательной З 5 среды, отличающийся тем, что, с цельюулучшения условий выращивания, регулирование давления кислородсодержащего газа и углсводородсодержащего газа в водной питательной среде осуществляют таким образом, 40 что оно обеспечивает весовое отношение растворенного кислорода к растворенному углероду в среде до 5-кратного по сравнению со стехиометрическим весовым отношением потребленного кислорода к лотребленному углероду 45 при образовании биомассы, при этом производят одновременное регулирование общего давления газа и общего парциального, давления кислорода, чтобы в среде было менее чем 30 ч/млн общего растворенного кислорода.444375 оставитель Т, Маев гайлин Те Редактор рилк орректо Заказ 222 дписное НИИ Типография, пр, Сапунова, 2 Изд. Юа 575 Тираж 456 Государственного комитета Совета Министро по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5