Способ обработки клеток бактерий, имеющих глюкозоизомеразную активность, перед процессом получения продукта, содержащего фруктозу — SU 712030 (original) (raw)
ц 712 ОЗО Союз СоветскихСоциапистическихРеспублик 1) Дополнятел 2) Заявлеио23) Приоритет й к патенту1 б 8б 8/28 2 О 13/О 03.09.74СШАБюллетень % 3ания 05.02.80 Гфсудерстеваых юетет СССР ве делам мзебретеею а ютхрыткй2) Автор изобретени Иностранная фирма Майлз Лабораториз, Инк(54) СПОСОБ ОБРАБОТКИ КЛЕТОК БАКТЕРИЙ, ИМЕЮЩИХ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗНУЮ АКТИВНОСТЬ, ПЕРЕД ПРОЦЕССОМ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКТА, СОДЕРЖАЩЕГО ФРУКТОЗУлетки. ки бактерий, обладаюазной активностью, смературе О - 27 С с водкозы при рН 8,0, нзме. для гнлратации клеток иобразуют слой клеток этого клеюкозоиэомепри темпствором глпри 25 Сзации рН,щие гл шиваю ным ра ренном ста били способов обработкиющих глюкоэоиэоме Известен олин и клеток бактерий, им разную активность Изобретение относится к области биохии.Известно, что глюкозоизомеразный феможет б т исп ьэ ван я каталити Р мент ы ь ол о длческого ускорения переработки глюкозы (лекстрозы) во фруктозу левулезу), которая обладает более высокой способностью подслащивания, чем исходный материал. Глюкоэонзомераза образуется главным образом внутри клеток бактерий, которые растут в процессе их производства. Эти клетки отфильтровывают из культуральной среды и не- посредственно используют в качестве источника .глюкозонзомеразы.Желательно, чтобы клетки бактерий, обладающих активностью глюкозоизомеразы, могли использоваться в непрерывном процессе нзомерацин глюкозы во фруктозу. Предлагались различные способы иммобилизации фермента для того, чтобы ои мог быть повторно использован в непрерывном процессе. 2Суть способа заключается в обработке клеток бактерий глутаровым альдегилом, При этом глюкозоизомераза иммобилиэуется в клетках и клетки могут быть использованы в реакторе с перенашнванием нлн в колонне нзомеризации. Однако установлено, что если клетки бактерий с иммобилизованной глюкоэоизомеразной активностью не будут обработаны перел использованием в качестве катализаторов нэомеризацин, то они не будут иметь удовлетвори. тельную физическую устойчивость, а это ухудшает гидравлические характеристики колонны. В результате получаемый нэомеризованный сироп может иметь нежелательную окраску, а время жизни фермента будет недостаточно продолжительным.Целью изобретения является придание к ам бактерий физической устойчивоси пропускают через него водный раствор глюкозы при 60 С и рН 7,5 - 8,0, измеренном при 60 С, до получения прозрачного раствора и стабилизации рН на уровне 7,5 - 8,0, измеренном при 60 С. Целесообразно, чтобы водный раствор глюкозы имел декстрозццй эквивалент 97 - 98 и 30 - 50 вес.% сухих веществ, из которых глюкоза составляет 93 - 96 вес.%, Можно использовать для осуществления этого способа клетки бактерий, . обработанные глутаровым альдегидом, Пропускать водный раствор через слой клеток следует снизу вверх при величице расхода 53 - 61 л/м площади поперечного сечения в 1 мин. Водный раствор глюкозы может содержать кобальт в концентрации 0,0005 м/л, магний -- 0,005 - 0,007 м/л и 0,01 Я лимонную кислоту.Клетки бактерий с глюкозоцзомеразцой активностью могут быть получены с помощью хорошо известных способов. Предпочтительные эцзимсодержащие клетки получают глубинным выращиванием в аэробцых условиях культуры Иге р 1 о посев о 11- асецз ХМК 3583 или его мутантов в среде, содержащей соответствующие питательные вещества. Г 1 олучаемые клетки бактерий отделяют от культуральной среды фильтро.ванием или центрифугцрованием.Для иммобилизации глюкозоизомеразы могут быть использованы различцые хорошо известные способы. Предпочтительно отделенные клетки бактерий суспецдировать в водной среде и смешивать с глутаровым альдегидом в количестве примерно от 0,1 до 60 вес.% (в пересчете на сухое вещество клеток),Так как обработанные клетки бактерий, содержащие фермент, обычно вырабатывают в ином месте и раньше того времени, когда получают продукт, содержащий фруктозу, то для хранения и транспортировки клетки обычно высушивают. Такое высушивание до величины влагосодержация примерно 3 - 10 вес.% может быть осуществлено в любом сушильном аппарате при температуре примерно 60 - 70 С. Получаемые аггломерированные высушенные клетки затем сортируют по размеру для последующегоиспользования в слое колонны. Аггломерированную высушенную массу клеток обычно разделяют на небольшие части при минимальном нажиме на клетки. Эти части помещают на сита для получениА фракции, которая задерживается на сите 60 меш и проходит через сито 20 меш,Если приготовленные аггломераты /слеток бактерий должны использоваться в производстве сиропа из глюкозы, содержащего фруктозу, то их перед тем как поместить в колонну, обрабатывают согласно изобретению. Если в колон ну за грузить цеобработанные клетки, то необходимо значительное время до того, чтобы реакция изомеризации стабилизировалась в относительно постоянном состоянии. В течение этого времени получаемый изомеризованный сироп имеет нежелательную окраску. При этом время жизци клеток (физическая устойчивость) короткое.Соответственно описанному способу клетки прежде всего смешивают с водой или с водным раствором глюкозы. Этот последний раствор может состоять из глюкозы, растворенной в воде. Предпочтителен состав из осахаренного раствора высококачественной глюкозы, получаемого энзиматической переработкой крахмала. Этот раствор глюкозы должен содержать примерно 30- - 50 вес.% растворенных твердых веществ, а также твердые вещества должны содержать прцмерцо 93 - 96 вес.% глюкозы, Глюкозный эквивалент раствора глюкозы составляет примерно 97 - 98. Воду или раствор глюкозы используют в количестве примерно 10 вес. ч, ца 1 вес. ч. высушенных клеток. Температура воды или раствора глюкозы составляет примерно 10 - 27 С. В воде или растворе глюкозы может содержаться также кобальт в виде хлорцда кобальта в мольцой концентрации примерно 0,005, магний в виде гидроокиси магния в мольной концентрации примерно 0,005 в ,007 и хелатцый и буферный агент (лимоцная кислота) в нормальной концентрации примерно 0,01, Лимонная кислота является предпочтительной потому,что оца образует растворимый хелатный комплекс с ионами кобальта и магция ц участвует в образовании буферного действия воды или раствора глюкозы при желаемой величине рН. Вода или раствор глюкозы должцы иметь рН 8,0 измеренный при 25 С. Такую величину рН обычно получают добавлецием соответствующего количества едкого цатра. Клетки и вода илц раствор глюкозы поддерживаются в контакте при минимальном перемешивации в течение примерно 1 ч. За это время происходит гцдратация клетки и стабилизация величины рН. Массу, состоящую из клеток и воды или раствора глюкозы, полученную на указанной стадии, направляют на соответствующую реакционную колонну с двойными стенками для получения слоя, имеющего толщину в отстоявшемся состоянии примерно 89 - 100 см. Перемешивание массы должно быть минимальным для того, чтобы уменьшить всякое механическое повреждение аггломератов клеток. В одном из вариантов изобретения раствор глюкозы того же состава, что и описанные выше, с рН 7,5 - 8,0, замеренным при 60 С, пропускают (при температуре примерно 60 С) снизу вверх через слой клеток при. расходе примерно712030 слоя в 1 мин. Это такой расход, .который дает увеличение установившегося объема аггломератов клеток прймерно на 50 - 60 об.%. Оц также обеспечивает желаемую классификацию и перегруппировку аггломе 5 ратов клеток. Когда начинает поступать раствор глюкозы, в рубашку колонны пропускают теплоагент с температурой 60 С. Раствор, выходящий из верхней части колонны, имеет значительное количество окрашивающих веществ, так как он содержит различные остатки клеток бактерий, Горячий раствор глюкозы следует пропускать снизу вверх через колонну до тех пор, пока выходящий поток не станет светлым и пока рН выходящего потока не установится ца величине ,5 - 8,0, измеренной при 60 С. Это требует раствора в количестве примерно равном 2 - 3 об. слоя в 1 ч в течение 1 - 3 ч. Затем подачу раствора глюкозы прекращагот и слою клеток дают отстояться. Для уменьшения количества раствора глюкозы, требуемой для такой предварительной обработки, слабо окрашенную часть выходящего раствора глюкозы можно использовать повторно. Величина рН рециркулируемого материала должна быть доведена до 7,5 - 8,0 и и замерена при 60 С.В варианте изобретения клетки в колонне реактора первоначально обрабатывают пропусканием водного раствора того же состава, что и водный раствор, описанный выше, при температуре примерно О - 27 С изО рН 8,0 измеренном при 25 С, снизу вверх через слой клеток до тех пор, пока выходящий раствор це станет светлым, а рН це установится 8,0 (измеряется при 25 С). После этого пропускают водный раствор глюко- з 5 зы того же состава, что и описанный выше раствор глюкозы, снизу вверх через слой при температуре 60 С и рН 7,5 - 8,0, измеренном при 60 С, до тех пор, пока выходящий поток це будет иметь такое же содержание глюкозы, что и входящий поток глю коз ьг.Во время указанной вьпце обработки водный раствор и водный раствор глюкозы рециркулируют через слой, Величину рН рециркулируемого материала доводят до же- ф лаемого уровня добавлением щелочи.Все растворы глюкозы, которые вступают в контакт с клетками бактерий, имеют глюкозоизомеразную активность, которая содержит некоторое количество фруктозы, об гг разованной реакцией изомеризациц. Следовательно растворы глюкозы, используемые на указанных выше стадиях ггредварительцой обработки, могут быть обесцвечегяы углем, умягчены ионообмениыми материалами, а затем использованы в качестве компонентов фруктозосодержащих продуктов. При необходимости берут 300 г сухихклеток и смешивают с водным раствором глюкозы, полученным эцзнматической обработкой крахмала. Этот раствор имеет глюкозный эквивалент 97 и содержит 30 весрастворенных твердых веществ. Твердые вещества содержат 94 вес.% глюкозы. Температура раствора 10- 27 С. Его используют из расчета О вес. ч. навес. ч.высушенных клеток. В растворе также содержится хлорид кобальта в когщентрации 0,0005 м/л, гидроокись магния в концентрации примерно 0,005-0,007 м/л и лимонная кислота в нормальной концентрации примерно 0,01. В него добавляют гндроокись натрия в количестве, достаточном для того, чтобы поддерживать р 11 раствора на уровне 8,0, замеряемый при 25 "С. Клетки выдерживают в контакте с раствором глюкозы примерно 53 - 61 л/м площади поперечцого сечения бКлетки, обработанные указанным способом, затем могут быть использованы для получения изомеризованного сиропа, Раствор глюкозы описанного состава может быть пропущен нисходящим потоком через слой при величине рН примерно 8,0 ц температуре примерно 60 С для получения продукта, содержащего примерно 42 - 48 вес,% фруктозы, в зависимости от расхода потока, Аггломераты клеток, предварительно обработанные по предлагаемому способу, имеют высокую физическую стабильность и хорошие гидравлические характеристики, вполгге подходящие для использсь."ггця в сравнительно толстых слоях (76 - 102 см), Использование клеток, обработанных по известным способам, должно ограничиваться тонкими слоями (1,3 - 10,2 см) при крайне большой площади поверхности.Пример /. Культуральную среду, содержащую клетки бактерий 5 гер 1 овусев Ж- чэсецвйИЯВ 3583, получают выращиванием таких клеток в среде, содержащей ксилозу, Величину рН культуральной среды доводят до 8,2 добавлением гидроокиси натрия. Водный раствор глутарового альдегида добавляют в бродильную среду из расчета 7 вес.% (на сухое вещество клеток в среде). Полученную смесь перемешивают в течение 1,5 ч. В это время добавляют гидроокись натрия для поддержания величины рН на уровне 8,2. Затем клетки профильтровывагот, промывают до рН 8,0 и затем высушивают при 60 - 70 С до содержания сухих веществ 3 - 10 вес.%. Высушенные клетки фракционируют на сите для получеггия фракции, которая задерживается ситом 60 меш и проходит через сито 20 меш. Г 1 олучецные отсортированные и высушенные аггломераты клеток бактерий; содержащие иммобилизованную глюкозоцзомеразу, затем помещают на хранение при комггатной температуре перед их дальнейшим использованием.712030 1 О ЗО 33 Затем водный раствор, описанный в примере 1, при 60 С и рН 7,5 - 8,0 (нзмеряют при 60 С) пропускают снизу вверх через слой клеток при величине расхода 53 - 6 лфя" площади. поперечного сечения в 1 мин до тех пор, пока состав выходящего из слоя раствор. не будет таким же как и входящий раствор глюкозы. При поступлении раствора глюкозы в слой клеток через рубашку колонны пропускают теплоа гент с температурой 60 С. Подачу раствора глюкозы прекращают и слою клеток дают отстояться в течение примерно 15 - 20 мин. Во время указанной обработки водный раствор и последующий раствор глюкозы рециркулируют через слой клеток, Величины рН рециркулируемых водного раствора и иоследуЮгцего раствора глюкозь. поддерживакгг соответственно на уровне 8,0 (измеряют ири 25"С) и на уровне 7,5 - 8,0 (измеряют ирн 60 С) путем добавления гидроокиси ивгрия. слоя в 1 час. В этом случае расход составляет примерно 22 л/м площади поперечного сечения вч. Величину рН раствора глюкозы поддерживают равной 8 (замеряемой при 60 С) путем добавления гидроокиси натрия. Получают изомеризованный си. роп, содержавший примерно 42 - 43 вес,% фруктозы в пересчете на вес растворенных твердых веществ, не имеющий окраски и не содержащий псикозы (рз 1 созе). Когда расход подачи сиропа глюкозы уменьшают до 3 О 1,1 об. слоя вч (6,3 л/м в 1 ч), то получают продукт, содержащий примерно 45 - 46 вес.% фруктозы (в пересчете на вес растворенных твердых веществ)неимею,щий окраски и не содержащий глюкозы, 33Указанный слой клеток использовали непрерывно лля изомеризации в течение бо-, лее 000 ч и при этом активность аггломерав течениеч, для их гидратации и выравнивания рН.Голученную массу клеток н раствор глюкозы направляют в реакционную колонну диаметром 3,75 см, снабженную рубашкой, и образуют слой клеток толщиной примерно 89 - 100 см. Перемешивание массы должно быть минимальным для того, чтобы уменьшить всякое механическое повреждение гидратированных клеток. Раствор глюкозы того же состава, что описанный выше, с рН 7,5 - 8,0. (измерен.при 60 С) проО пускают при 60 С снизу вверх через слой клеток при расходе потока 53 - 6 л/м плогцади поперечного сечения вмин.При поступлении в раствор глюкозы в слой через рубашку колонны пропускают теплоагент с температурой 60 С. Горячий раствор глюкозы пропускают снизу вверх через колонну в течение 1 ч до тех пор, пока выходящий раствор не становится светлым и величина рН не устанавливается на уровне 7,5 - 8,0 (измеряют при 60 С). Затем подачу раствора глюкозы прекращают и клеткам дают отстояться в течение5 - 20 мин. Во время указанной обработкираствор глюкозы рециркулируют через слойклеток. Величину рН рециркулируемогораствора глюкозы поддерживают равной7,5 - 8,0 (измеряют при 60 С) путем добавления гидроокиси натрия. Во время обработки величину рН нельзя уменьшать ниже7,0,так как это может привести к физическому повреждению аггломерато 6 клеток,После этого слой клеток готов к использованию для изомеризации глюкозы во.фруктозу,Раствор глюкозы того же самого состава, что и описанный выше, пропускают самотеком при напоре примерно 10,2 - 15,2 смчерез указанный слой при температуре 60 С и расходе примерно равном 1,5 объемам тов клеток уменьшились весьма незначительно .При использовании клеток, не обработанных по описанному способу, они теряли по меньшей мере половину своей энэимной активности примерно после 500 - 600 ч непрерывной работы,Пример 2. Аналогично примеруполучают порцию отсортированных по размеру аггломератов клеток бактерий (300 г), содержа ших иммобилизованную глюкозоизомеразу. Приготавливают водный раствор, со держащий хлорид кобальта в концентрации примерно 0,0005 м/л, гидроокись магния в концентрации примерно 0,005 в ,007 м/л, лимонную кислоту в нормальной концентрации примерно 0,0 и гидроокись натрия, в количестве, достаточном для поддержания величины рН на уровнях, измеряемой при температуре 25 С. Затем высушенные клетки смешивают с этим водным раствором при О - 2 ГС в количестве 1 О вес. ч. воды на 1 вес. ч. высушенных клеток. Последние поддерживают в контакте с водным раствором в течение примерноч. Полученную массу клеток и водного раствора направляют в реакционную колонну диаметром 3,75 см, снабженную рубашкой, и образуют слой клеток толщиной примерно 100 см. Водный раствор того же состава с рН 8,0 (измерен при 25 С) пропускают при температуре 10 - 27 С снизу вверх через слой клеток при величине расхода 53 - 6 л/м плошади поперечного сечения в 1 мин, Водный раствор пропускают снизу вверх через колонну примерно в течение 1 ч до тех пор, пока выходящий поток не станет светлым, а величина рН выходящего потока не стабилизируется на уровне 8,0 (измеряют при 25 С). Подачу водного раствора прек ра ща ют.7 т 1030 О формула изобретения Составители М. Андреева Редактор А, Бер Текред . Шуфрнч Корректор М. Деючнк Заказ 9652/45 тираМ А 33 Подписное ЦИ И И ПИ Государственного комитета СССР по дмам изобретений н открытий 133035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5 фнанал ППП Патент, г. Ужгород, уд. Проектная, 4Полученный обработанный слой клеток затем используют для изомеризации глюкозы во фруктозу способом, описанным в примере 1, для получения изомеризованного сиропа, содержащего примерно 42 - 43 вес.% фруктозы, не имеющего окраски и не содержащего псикозы. Обработанный указанным способом слой клеток физически .устойчив,1. Способ обработки клеток бактерий, имеющих глюкозоизомеразную активность, перед процессом получения продукта, содержащего фруктозу, отличающийся тем, что, с целью придания клеткам бактерий 13 физической устойчивости, смешивают клетки при температуре 10 - 27 С с водным раствором глюкозы при рН 8,0,измеренном при 25 С для гидратации клеток и стабилизации рН, образуют слой клеток и пропускают через него водный раствор глюкозы при температуре 60 С и рН 7,5 - 8,0, измеренном при 60 С, до получения прозрачного раствора и стабилизации рН на уровне 7,5 - 8,0,измеренном при 60"С.2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что водный раствор глюкозы имеет декстрозный эквивалент 97 - 98 н 30 - 50 вес.% сухих веществ, из которых глюкоза составляет 93 - 96 вес.%.3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют клетки бактерий, обработанные глутаровым альдегидом.4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что водный раствор глюкозы пропускают через слой клеток снизу вверх при величине расхода 53 - 61 л/м площади поперечного сечения в 1 мнн,5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что водный раствор глюкозы содержит кобальт в концентрации 0,0005 м/л, магний - 0,005 - 0,007 м/л и 0,01 М лимонную кислоту.Источники информации,принятые во вни иание при экспертизе 1. Патент Великобритании1376983, кл, С 3 Н, опублнк. 1971.