Способ получения вакцин против лейкоза крупного рогатого скота — SU 820015 (original) (raw)

(19) 01) 61 К 2 С 12 Б 5/О НИ л ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ ПИСАНИЕ ИЗОБРЕ ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Научно-исследовательский институт микробиологии им. Августа Кирхенштейна иМосковскаяветеринарнай академия имени К.И.Скрябина(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫПРОТИВ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО".СКОТА, включающий культивирование вируссодержащих клеток, отделение клеток и выделение вирусного материала из культуральной жидкости, - о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения иммуногенных свойств вакцины, в качестве вируссодержащих клеток используют лейкоциты периферической крови крупного рогатого скота, больного лейкозом, при этом от- деленные клетки и вирусный материал подвергают разрушению с одновременным инактивированием содержащихся в них нуклеиновых кислот и последующим РФ выделением белковых фракций р 25, и дР 70, используемых в качестве иммунизирующего агента.8200 40 1Изобретение относится к областиветеринарии, в частности, к способам производства вакцйн против лейкозных заболеваний крупного рогато"го скота.5В настоящее время известен способполучения вакцин против лейкозныхзаболеваний у различных животных Вкачестве примера можно указать спо 10соб получения вакцины для иммунизации птиц против лимфоидного лейкозаи эритробластоза путем получениясмеси живых клеток и измельченныхтканей, инфицированных этим вирусом15в фармацевтической жидкости, приэтом концентрация смеси такова, чтов 10-2000000 мл жидкости содержится1 г смеси. В качестве исходного материала используют ткань почки сеЭлезенки или печени больного животного.Известна также вакцина против лейкоза кошек, получаемая иэ клеток:культуры, инфицированной вирусом лейкоза кошки. Вакцина состоит из кле 25ток, зараженных вирусом лейкоза кошки или из инактивированных частицвируса лейкоза кошки, выделенныхиэ клеток культуры.Однако вакцины, полученные известным способом, неэффективны для предупреждения лейкоза крупного рогатого скота. Кроме того, вакцины, полученные известными способами, содержат нуклеиновые кислоты как вирусного, так и клеточного происхождения,которые опасны как источник опухолевой информации с потенциальной воэможностью индуцирования опухолевогозаболеванияКак недостаток известных способовследует отметить, что .для полученияиммунизирующего материала требуетсязабивание животного - донора,Целью настоящего изобретения является повышение иммуногенных свойстввакцины. В качестве вирусосодержащих клеток используют лейкоциты периферической крови крупного рогатогоскота, больного лейкозом, при этом 50отделенные клетки и вирусный материал подвергают разрушению с одновременным инактивированием содержащихся в них нуклеиновых кислот и последующим выделением белковых фракций 55р 25 и кР 70, используемых в качестве иммунизирующего агента.П р и м е р 1, Из периферическойкрови методом гемолитического тока 15 2эритроцитов с последующим восстановлением изотопичности раствора выделяют лейкоциты. После чего производят засев в культуральную среду следующего состава: инактивированнаябычья сыворотка - 107., 0,5-лактагумин - 207., среда Игла - 707. из расчета 5 10 ф клеток на 1 мл среды.После 72 чкультивирования отделяюткультуральную среду, при этом осаждают лейкоциты центрифугированиемпри 1600-1800 об/мин в течение20 мин.Лейкоцитарные клетки разрушаютв буфере А (неионный детергент тритон Х 100) до 1 Е-ной конечной концентрации, затем производят обработку магнитной мешалкой в течение 1 чпри температуре +4 С, центрифугируют при 25000-30000 об/мин в течение1 ч.Супернатант подвергают диализу втечение,12-15 ч, после чего центрифугируют при тех же оборотах, отделяяантигенбелковую фракцию. Антигенподвергают лиофильной сушке. Полученный материал вводят в предлопаточный лимфоузел телятам в возрасте 1-3месяца с полным адьювантом Фройнда всоотношении 1:1. Доза иммуногенаопределялась по белку, количественное определение которого проводилосьпо методу Лоури (журнал Во 1 оцхса 1СЬепд.зЬгу, ч. 193, М 1, стр. 265,1951),Иммунизацию проводят трехкратнос интервалом 10-12 дней, Вторая,третья и четвертая иммунизация безадьюванта Фройнда. Через 4 неделипосле четвертого введения препаратав периферической крови иммунизиро-ванных телят констатированы реципитирующие антитела к вирусным белкамР 70 и Р 25 в титрах 1:16-1:32. Напряженность иммунитета составляет6 месяцев.П р и м е р 2. Культуральную жидкость после отделения лейкоцитов осветляют центрифугированием при6000 об/мин в течение 20 мин, затемпроводят дифференциальное центрифугирование при 30000 об/мин в течение1,5 ч. Осадок ресуспендируют в буферном растворе ТНЕ, растирают впоттере Даунса"и осветляют при6000 об/мин, Полученный вирусныйматериал обрабатывают тритоном Х 100до конечной концентрации 0,04 Х иподвергают многократному криолизу.40 з 8200 Полученный продукт деструкции вирусного препарата совместно .с полным адьюванчдм Фройнда вводят в шейный лимфоузел в следующих дозах по белку: 1-я иммунизация - 20 мг/мл, 2-.я 30 мг/мл, 3-я - 50 мг/мл. Схема иммунизации аналогична примеру 1. Титр антител к вирусным белкам через 3-4 недели равен 1:8-1:16.П р и м е р 3, Выделяют белковые фракции Р 25 и цР 70 следующим методом. Вирусный материал, полученный в примере 2, очищают дважды в градиенте сахароэы 15-603, обрабатывают тритоном Х 100 до концентрации 0,0053 и помещают в термостат при 37 С на 1 ч Полученный материал осветляют при 30000 об/мин в течение 90 мин, подвергают диализу против фосфатного бу 20 ферного раствора в течение суток при +4 С, вновь осветляют при .6000 об/мин в течение 1 О мин. Супернатант подвергают Фракционированию на аппарате изоэлектрофокусировки. Собранные белковые положительные фракции в реакции ИД в агаре объединяют, рН эоны 7,2- 7,5 (пик 7,4). Затем полученный материал подвергают диализу противо 0,01 мл Фосфатного буфера при +4 С в течение суток со сменой буфера.30 Материал концентрируют акрилексом; очищают на колонке ифадекс Д., Выделенные белковые Фракции совместно с полным адьювантом Фройнда вводят в предлопаточный лимфоузел в следую- ЗБ щих дозах по белку: 1-я иммунизация -10 мг/белок, 2-я - 15 мг/мл, 3-я - 25 мг/мл, Схема иммунизации аналогична примеру 1.Титр антителчерез 3-4 недели после 3-ей иммунизации равен 1:32- 1:64.П р и м е р 4. Из периферической крови больного лейкозом крупного рогатого скота животного выделяют клет-. 45 ки, как описано в примере 1. Полученные нативные клетки разрушают в буфере А (Неионный детергент тритон Х 100) до 1 Е конечной концентрации. Затем производят обработку на маг нитной мешалке в течение часа при температуре +40 С, центрифугируют при 25000-30000 об/мин в течение часа. Супернатант подвергают диализу в течение 12-15 ч, после чего центрифугируют при тех же оборотах, отделяя белковые фракцйи Р 25 и яР 70 - антиген, который подвергают лиофильной сушке. 15 4Полученный материал вводят в надлопаточный лимфоузел телятам в возрасте 1-3 месяца с полным адьювантом Фрейнда по белку: 1-я иммунизация - 25 мг/мл, 2-я иммунизация - 37,5 мг/мл, 3-я - 60 мг/мл.Схема иммунизации аналогична примеру 1. Титр антител к вирусным белкам 3-ей иммунизации через 4-5 недель равен 1;16-1:32П р и м е р 5., Культуральную жидкость 72-х часовой культуры лейкоцитов, полученных от больных животных 1 сливали, осветляли при 5000 об/мин. в течение 10 мин, затем при 12000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость собирали и "центрифугировали при 30000 об/мин (950000 я) на центрифуге ЧАСв угловом роторе 685 мл в течение 1,5 ч. Полученный осадок ресуспендировали в малом объеме буфера ТЛЕ, содержащего 0,01 М Трис-НСХ; 0,1 М БаСХ; 0,001 М ЭДТА рН - 7,4, гомоге- низировали в стеклянном гомогенизаторе. Гомогенат центрифугировали при 8000-9000 об/мин в течение 30 мин.Надосадочную жидкость подвергали очистке, пропуская материал через слой 207. раствора сахарозы при 30000 об/мин в горизонтальном роторе центрифуги ЧАСв течение 1 ч. Осадок после данного этапа очистки .снова суспендировали в буфере ТИЕ, гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе и подвергали очистке в линейном градиенте концентраций сахаро-эы. Градиент готовили при помощи градиентообразователя из 153 и 607. растворов сахарозы На приготовленный градиент наслаивали вирусную сусненэию, очищенную через слой 207. раствора сахароэы. Центрифугировали в горизонтальном роторе 330 мл центрифуги ЧАСпри 3000 об/мин в течение 4-х ч. Градиент после центрифугирования Фракционировали и Фракции собирали при помощи перистальтического насоса КВ или автоматической системы регистрации Ъхсогй" и Фрак-, ционного коллектора установки "СоХо- . га" (ЬКВ-Швеция). Фракции с плотностью 1,16-1,18 г/мл собирали, пере- осаждали при,30000 об/мин (95000 д) в центрифуге ЧАСв течение 1 ч. Собранные осадки ресуспендировали в ТБЕ буФере, разливали во Флаконы или ампулы и хранили при -190 С (срок хранения 6-8 месяцев).,лейкоцитов, полученных от больныхлимфолейкозом коров были собраны,отцентрифугированы при 1200 об/мин. в течение 20 мин, отмыты три раза0,85% раствором БаСЗ. с последующимосаждением при 1200 об/мин в течение1 О20 мин, Клетки лизировали, ресуспендируя их в буфере А, содержащем0,02 М Трис-НСЗ.; 0,3 М КСЗ., 0,01 Мазида Иа и 1% тритона Х; рН,8.Суспензия встряхивается на холоде(+4 ). Надосадочную жидкость собирали, диализировали против дистиллированной воды (1;2000) в течение суток. Экстракты после диализа вновьосветляли при 24000 я - 45 мин (+4 С).б) антигенные экстракты из очищенного и концентрированного вирусаБЛВ,25 Вирус, очищенный двумя циклами дифференциального центрифугирования и центриАугирования в градиенте плотности сахарозы 15-60%, ресусненди- ЗО ровали в ТБЕ буфере, содержащем 0,01 М Трис-НСЗ. 0,1 М ИаСЗ., 0,001 М ЭДТА; рН - 7,4,Вирус разрушали добавлением к сус- З 5 пензии тритона Хв концентрациис0;5/ инкубировали смесь с тритоном, в течение 1 ч при 37 С. После инкубации смесь центрифугировали при 30000 об/мин в течение 1,5 ч. Осад ки после центриАугирования отбрасывали, надосадочную жидкость диализовали против воды (1;400) за ночь при +4 С с двумя сменами воды. Материал повторно осветляли центрифугированием45 при 6000 об/мин в течение 10 мин,П р и м е р 7. Антигенные экстракты клеток и вируса (описано выше) наносили вколонку 1 КВ (110 мл) для, изоэлектрофокусирования. Условия изоэлектрофокусирования.: амфолины 50 1%; диапазон рН 3-10; начальные параметры:.7 - 300 В 1 - 8 мА; Ч - 2,4 Вт; конечные параметры: 7 - 300 В;1 - 08 мА; Ч - 0,24 Вт; время фокусирования - 48 ч.Собирали фракции с колонки по 40 капель с одновременным измерением рН и А ц, (оптической плотности),Все собранные фракции тестировали в иммунодиффузии. Собирали фракции, положительно реагирующие с сы-вороткой крупного рогатого скота,специфичной к рБЛВ.Положительно реагировали Аракции в зоне рН 7,3-7,5, пик активности - в точке рН 7,4,Положительныефракции собраны,отдиализованы против 0,01 М фосфатного буАера.Следующий этап очистки проводилина колонке с сефадексом Г(1,5100 см с водяным охлаждением).Сефадекс Гпредварительно многократно отмывали от мелких частиц иуравновешивали буфером, содержащим0,05 М Трис-НСЗ., рН - 7,8; 0,3 МКСЗ., 0,01% тритона Х.Фракции колонки проверяли в иммунодиффузии со специфической сывороткой. Собирали положительно реагирующие Фракции. Очищенный таким образом белок в полиакриламидном гелепри электрофорезе дает полосу в зоне с молекулярным весом 25000 дальтон.П р и м е р 8. Выделение двойного антигена. Вирус концентрируют изкультуральной жидкости вируспродуцирующей культуры сульАатом аммония.Для этого: к культуральной жидкости добавляют сухой сульфат аммонияиз расчета 30 г/100 мл среды; охолаждают при 4 С в течение ночи; центрифугируют при 1000 об/мин 1 ч инадосадочную жидкость сливают; осадок ресуспендируют в дистиллированнойводе 1:10 объема; охлаждают ночь ицентрифугируют при 1000 об/мин30 мин. Надосадочную жидкость оставляют, осадок отбрасывают; надосадочную жидкость диализуют против АосФатно-солевого .буйера; после диалиэажидкость концентрируют ультрафильтра-,цией (йпхсоп - аппарат, мембраны РМ 10) в 100 раз по отношению к исходному объему; после концентрирования материал центрифугируют при 30000 я втечение 1 ч. Супернатант собирали. Онсодержит оба антигена - Ри гликопротеин. Таким образом, разработан способ получения эффективной и безопасной вакцины против лейкоза крупного рогатого скота, при котором животное- донор остается живым. В результате применения данной вакцины полученыТираж 594 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наф., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 7высокие титры антител до 1:32-1:64, а также устойчивый напряженный иммунитет. Кроме того, данный способ по-зволяет получать вакцину без нуклеиковых кислот, являющимися источником опухолевой информации потенциально опасной в системе индуцгрованияопухолей.

Смотреть

Способ получения вакцин против лейкоза крупного рогатого скота