Способ получения антибиотика g-6302 — SU 1003761 (original) (raw)
(54 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИ 6-6302равных в райрефектура Каван в инсти(1 ГО) подктеризуется олог ется 6-631(е собаУк что с биоти ния - созданиентибиотика С ь достигается тсобу получения по ль изобретеполученияазанная целогласно спка Формулывне1) т ОС с-с-си;сн хоаоцистио н обретение относится к микробической проьышленности и касаспособа получения антибиотика штамм Р ьеодощопа аседорп1 а 6-630АТССкультивируют в аэробныхусловиях в питательной среде, содежащей источники азота, углерода иминеральные соли, с последующим отделением культуральной жидкости ивыделением целевого продукта.При этом, с целью повышения выда целевого продукта, культивировие ведут на питательной среде, сдержащей дополнительно метионин,теин, цистин, сульфат натрия илисульфат натрия,Используемый для осуществленияспособа штамм Рецдовопаь 0-6302 в делен из проб почвы, сооне Ашигара-Мимон-Гун,Юагава, Япония, депониртуте Ферментации, Осаканомером ГО 13774 и харследующими признаками. турально-морфологические признаки.По истечении 2-х дней наа питатель. - ном скошенном агаре при 28 С клетки приобретают форму стержней диаметром 0,7-1,0 мк и длиной 0,7-3,5 мк. Подвижная с полярно расположенной жгутиковой зооспорой или полярно расположенным жгутиком, неполиморфна. Неспорулирующая: без накопления поли- бета-оксимасляной кислоты в качестве внутриклеточного углеродного запаса. Грам-отрицательная, кислотонеустойчивая. При выращивании при 28 С в течение 1-14 дней проявляет следующие свойства,На питательном агаре образует круглые колонии диаметром 1-3 мм с полным оФормлением кромок по истечении 3-х дней; однородные: непрозрачные, белые, растворимый пигмент отсутствует.Питательный скошенный агар. Ростумеренный, нитевидной формы, непрозрачный, кремовой окраски.Жидкая питательная среда, Мутноеновообразование, практически безседиментации. По истечении 14 днейкультивирования образует тонкую пленку.Питательный желатиновый столбик,Поверхностный рост, без разжижения.физиолого-биохимические свойства, 10Лакмусовое молоко не изменяет.Нитраты в нитриты не восстанавливает. Денитрификация отрицательная.Проба на метиловый красный отрицательная. Проба Воджес-Прокауэра отри цательная. Сероводород образует (слабо положительная реакция), Крахмалне гидролизует. Нитрат калия усваивает слабо, сульфат аммония усваивает, Пигмент не образует. Уреаза положительная, оксидаза отрицательная,каталаза положительная.Растет при рН 4-8, оптимум рН4,5-6,0, температуре от 2 до 37 С,оптимум роста при 25-30 С. 25Аэроб. Окислительно-ферментативная проба - оксилительная.На средах с сахарами слабо образует кислоту, гаэ не образует,Ассимиляция источников углерода:хорошо усваивает арабинозу, О-ксило.зу, О-глюкозу, О-маннозу, О-фруктозу, мальтозу, сахарозу, трегалоэу,О-сорбит О-маннит, инозит, глицерин, альфа-метил-О-глюкозид, адонит,раффинозу, цис-аконитат, цитрат,изоцитрат, глюконат, ацетат, фумарат,малат, тартрат, п-оксибензонат,0 С -аланин, бета-алании, 1.-изолейцин,сукцинат, 2-кетоглюконат.40Не усваивает лактоэу, крахмал,мелибиозу, дульцит, 1.-валин.Малонат не использует.фенилаланин не деаминирует.Декарбоксилаэная активность: аргинин - отрицательная, лизин - отрицательная, орнитин - отрицательнаяреакция.Эскулин гидролиэует,Содержание гуанин-цитозина в дезоксирибонуклеиновой кислоте59,5 молСпособ осуществляют следующимобразом,Для культивирования штамма С могут быть использованы такие источники углерода, как глюкоза, сахароза,.мальтоза, отработанная меласса,глицерин, масла и жиры, органические кислоты, В качестве источникаазота - органические и неорганические азотсодержащие соединения, например соевая мука, мука хлопковыхсемян, кукурузный экстракт, сухиедрожжи, дрожжевой экстракт, мяснойэкстракт, мочевина, сульфат аммония 65 нитрат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, Неорганические соли хлорид натрия, хлористый калий, карбонат кальция, сульфат магния, первичный кислый фосфат калия, вторичный кислый фосфат натрияВыход антибиотика можно повысить путем доОбавления соединений серы - сульфатнатрия, тиосульфаты, серосодержащие аминокислоты - цистеин, цистин, метионин. Концентрации соединений серы поддерживают в питательной среде на уровне 0,01-1,0 (вес,об,), предпочтительно 0,02-0,5 (вес,об.). В питательную среду можно вводить соли тяжелых металлов, в частности сульфат двухвалентного железа, сульфат меди, а также витамин В , биотин.Культивирование в жидкой среде проводят в стационарных условиях при перемешивании, встряхивании в аэробных условиях. Температура культивирования от 15 до 35 С, рН питательной среды 4-8, Культивирование проводят в течение 8-168 ч, предпочтительно от 24 до 144 чАнтибиотик может быть выделен обычными способами, используемыми при выделении антибиотиков, а именно отделением клеток центрифугированием с последующей очисткой целевого продукта растворением в растворителе или осаждением из раствора, ионообменной хроматографией и др.П р и м е р 1. Клетки микроорганизма Рьендощопаь ас 1 дорЬ 11 а С(ГЕКИ-Р Р 4344,ГО 13774;ОТСС) выращенные на питательном скошенном агаре, используют для ионокулирования двух 2 х 10 об.ч. колб Сакагучи, содержавших по 500 об.ч. среды, которая включает в себя 1 глюкозы, 0,5 продукта полицептон, 0,5 мяс ного экстракта, 0,5 хлористого натрия, велйчина рН 7,0, после чего каждую колбу инкубируют на возвратно- поступательном встряхивателе при 28 С в течение 48 ч, Конечную культуру используют в качестве посевной культуры.Ферментер из нержавеющей стали емкостью 200 х 10 об. ч. заполняют 120 х 10 об.ч. среды, которая включает в себя 3 глицерина, 0,1 глюкозы, 0,5 полипептона, 0,5 мясного экстракта и 0,5 хлорида натрия, и после доведения величиры рН до 7,0 добавлением 30-го водного раствора гидрата окиси натрия ее ртерилизуют водяным паром при 120 С в течение 20 мин. Затем среду стерилизованного сосуда инокулируют указанной посевной культурой и инкубируют при 28 ф С с аэрацией при скорости подачи 120 х х 10об.ч./мин скорости вращения мешалки 180 об/мин в течение 78 ч, Конечный бульон подвергают центрифу65 гированию с помошью сепараторной центрифуги с плавным рабочим режимом для отделения клеточной массы, в результате получают 110 х 10 об.ч. верхнего слоя жидкости. Величину рН этой жидкости доводят до .4,2 и про 5 пускают через колонку с 15 х 10 об.ч.3 активированного древесного угля, Колонку промывают 45 х 10 об.ч.э50-го водного раствора ацетона, элюат собирают в виде 10 х 10 об.ч, Фракций. Отбирают фракции 2 и 3, проявляющие активность в отношениигойець щ 1 гаЬ 111 я, добавляют 20 х 10 об,ч. воды и смесь пропускают через колон 3ку, заполненную 10 х 10 об.ч. смолы 15 Даукс (хлорионная форма). Колонку промывают 25 10 об.ч. воды и элюируют 5010 об.ч. 5-го водного раствора хлористого натрия, Отбирают активные фракции, доводят рН до 4,0 и 20 вновь пропускают через колонку с ак 1 тивированным древесным углем (810 об.ч,). Колонку промывают 24 10 об,ч, воды и элюируют 20-ным водным раствором метанола (объем/ 25 /объем)Отбирают активные Фракции и.концентрируют до 50 об.ч. при пониженном давлении, Затем добавляют 200 об,ч. ацетона, осадок отфильтровывают, промывают 50 об.ч. ацетона и 100 об.ч, диэтилового эфира и высушивают при пониженном давлении, Получают 12 частей сырого продукта.В 500 об,ч. 0,01 М фосфатного буФера (рН 6,6 ) растворяют сырой продукт и раствор пропускают через колонку с 200 об,ч, продукта ДЕВЕ-сефадекс А, предварительно обработанного буфером. Колонку промывают 400 об. ч. того яе буфера, а затем элюируют тем же буФером, в который 40 предварительно добавляют 0,5 хлорис того натрия. Отбирают активные Фракции, доводят рН до 3,21 н. НС 1 и пропускают через колонку с 60 об,ч. активированного древесного угля. Ко лонку промывают 200 об.ч. воды и 100 об.ч. 20-го (объем/объем) водного раствора метанола с последующим элюированием 50-ным водным раствором ацетона (объем/объем). Отбирают 50 активные фракции, концентрируют при пониженном давлении и растворяют в 5 об.ч. метанола. Добавляют 100 об.ч. ацетона, смесь выдерживают на холоде, Образовавшийся осадок отделяют филь" 55 трованием, промывают диэтиловым эфиром и высушивают при пониженном давле нии пентоксидом фосфора при 40 С в течение 6 чПолучают 3,8 частей порошка.60 Антибиотик обладает следующими Физико-химическими свойствами.Температура плавления 120 С (спекание ), 130 С (с разложением). Белый порошок. Молекулярный вес400 + 20 (титрометрия ).Найдено, : С 34,83-35,45; Н 5,415,24, М 1322 13 с 73 5 765 775О 38,13+0,5,С Н М 5 0 Н 02. г.о 4 Спектрограмма ультра-фиолетовогопоглощения: только конечные частотыпоглощения (никаких характеристических поглощений при длине волны свыше210 нм) .Спектрограмма инфра-красного поглощения, доминантные пики (бромидкалия ), см : 3440 (си ), 2920 (ср ),2850 (ср ), 2600 (сл1770 (си ),1650 (си)1530 (си)1458 (ср), 1390 (сл)1340 (сл ), 1280 (пл ), 1240 (си ),1210 (пл ), 1180 (ср ), 1118 (сл ),1043 (си ), 792 (сл ), 632 (си ), гдеси - сильное, ср - среднее, сл - слабое поглощение, пл - плечо,Удельное вращение (плоскости поляризации ) 1 с 123+94 +10 (С,35, вода),Спектрограмма ядерно-магнитногорезонанса (в диметилсульфоксиде,100 мГц)5 3,31 рре (5 - определенный химический сдвиг в направлении),Нерастворим в петролейном эфире,гексане диэтиловом эфире, бензоле,Фэтилацетате и хлороформе, умереннорастворим в этаноле, пиридине и ацетоне, растворим в метаноле и диметилсульфоксиде; легко растворим в воде.Цветные реакции, Положительныес нингидрином и перманганатом калия,отрицательные - с хлоридом трехвалентного железа - феррицианидом калия, Сакагучи и Молиша; неопределенно положительные - реакция Эрлиха.Стоек в водном растворе в интеривале величин рН 3-7 при 60 С в течение 10 мин, нестоек при рН выше 8,5,Кислая реакция.П р и м е р 2, В ферментационный сосуд из нержавеюшей стал, емкостью 50.10 об.ч. загружают 35 " 10 об,ч. среды, которая содержит 3 глицерина, 0,1 глюкозы, 0,5 полипептона, 0,5 мясного экстракта, 0,5 хлористого натрия, затем величину рН этой среды доводят до 7,0 добавлением 30- го водного раствора гидрата окиси натрия и стерилизуют водяным паром при 120 С в течение 20 мин. Затем среду инокулируют продуцентом. Рнкуобируют при температуре 28 С с аэраз цией при скорости подачи 35 10 об. ч./мин и скорости вращения мешалки 180 об/мин в течение 48 ч., получая вторичную посевную культуру.Ферментационный сосуд из нержавеющей стали емкостью 20010 Зоб,ч, заполняют 1200 ф 10 об,ч. среды, коЭторая включает 3 глицерина, 0,1 глюкозы, 0,5 полипептона, 0,5 мяс 1003761ного экстракта, 0,5 хлористого натрия и 0,1 тиосульфата натрия, а после доведения рН до 7,0 добавлением 30-го раствора гидрата окиси нат рия среду стерилизуют водяным паром при 120" С в течение 20 мин. Затем среду инокулируют вторичной посевной культурой.Инокулированную среду инкубируют, при 28 С при аэрации со скоростью 10 подачи 1200,10 об.ч,/мин и скорости вращения мешалки 180 об/мин в течение 90 ч, в результате получают 115010об,ч. культуральной жидкости. 15В нее добавляют 40 10 ч. продукта Хифло-Супр-Сел и Фильтруют с помощью оилот-пресса Величину Фильтрата доводят до 4 добавлением 4 н, Н 2504 и пропускают через колонку с 120. 10 о.ч. активированного древесаного угля, Колонку проьювают 30010 об. ч. водь:, элюируют 50-ным (объем/объем) водным раствором ацетона. Отбирают активные Фракции и концентрируют при пониженном давлении для удаления ацетона. Полученный водный концентрат разбавляют 200.10 об.ч. воды и пропускают черезЪколонку, заполненную 50 10 з об,ч. продукта Дианон 5 АА (хлорионная Форма ), Колонку промывают 1-ным водным раствором хлористого натрия, Собирают активные фракции и концентрируют при пониженном давлении до конечного объема 10 ц об.ч., после чего добавляют 2109 об.ч. метанола и выпавший в осадок хлористый натрий отфильтровывают, После этого филь- трат концентрируют при пониженном давлении до объема 200 об,ч., а за тем добавляют 2 10 об.ч, .ацетона, выпавший в осадок продукт отделяют фильтрованием и высушивают, Получают 757 ч, сырого продукта, 500 ч сырого продукта растворяют в 510 об. ч, воды, доводят внлчин ОН до 4,0 и адсорбируют в колонке на активированном древесном угле (510 об,ч, ),3 Активный компонент злюируют по методу градиечтного злюирования с исполь зованием 10"10 об,ч., воды и 10ф 10 об.ч. 70-го водного раствора,Ъметанола (объем/объем) и злюат собирают 1.10 об,ч, фракций, Активные Фракции отбирают, концентрируют при пониженном давлении для удаления метанола и доводят обьем до 6 10 об.ч. добавлением 0,01 М ФосФатного буфера (рН 6,0 ), Пробный раствор для адсорбции пропускают через колонку с 310 об.ч. продук- ф та ДЕАК-С)-Фадекс А, приготовленный согласно примеру 1 затем колон 1 Рку промывают 6 10 об,ч. того же бу,Фера, причем элюирование производят ,тем самым буфером, в который добав ляют 0,5 хлористого натрия, злюатсобирают в виде 500 об.ч. фракций.Активную фракцию отбирают, доводятРН до 3 1 н, НС) и пропускают черезколонку с 0,510 об.ч. активированного древесного угля. Колонку промы.вают 2 10 об,ч. воды и 210 ф об,ч.20-го водного раствора метанола(объем/объем), а затем элюируют50-ным водным раствором ацетона(объем/объем), Отбирают 200 об,ч,Фракций. Активные фракции концентрируют при пониженном давлении и растворяют в 300 об.ч. метанола. Добавляют 3 10 об.ч. ацетона и 4 10 об.ч.дизтилового эфира и оставляют на холоде, выпавший осадок антибиотикаотфильтровывают, промывают дизтиловым эфиром и высушивают при пониженном давлении над пятиокисью Фосфора.Выход 72 г. Данные элементарного анализа, ; С 35,45, Н 5,24, М 13,73,5 7,75 (вес/вес) .П р и м е р 3. В 90 об.ч. водырастворяют 4,0 ч. антибиотика 6-6302в свободной форме (по примерам 1 и 2)на холоде и добавляют в раствор приблизительно 9,0 об.ч. 1 н. водногораствора МаОН, Затем добавляют дополнительное количество 1 н. раствораМаОН до достижения величины рН 6,5,Раствор высушивают вымораживанием,получают 4,2 мононатриевой солиСв виде белого порошка.Физико-химические свойства. Отсут-.ствует определенная температура плавления (приобретает коричневую окраску при 170 С),Белый порошок. Молекулярный вес438.5,Найдено, : С 33,08, Н 5,07,12 ю 73 5 733 Ма 5,18.С Н М,50 Ма Нд 0Вычйслено,С, 33(03 р Н 4 85М 12,84, 5 7,35, Ма 5,27.Спектр ультрафиолетового поглощения: только конечные поглощения,Спектрограмма инфра-красного поглощения, домин 1 антные пики (бромистый калий), см : 3430 (си), 3250 (пл),3000 (ср), 1770 (си), 1640 (си),1530 (си), 1450 (сл), 1405 (сл),1343 (сл), 1280 (пл), 1245 (си),1180 (сл), 1118 (сл), 1050 (си),820 (сл), 782 (сл), 632 (си).Удельное вращение: М.1 + 85 + + 10(С,37, вода), Нерастворим в петролейном эфире, гексане, диэти ловом эфире, бенэоле, этилацетате, хлороформе и ацетоне, слабо растворим в метаноле, этаноле и пиридине, растворим в диметилсульфоксиде, легко растворим в воде.Дветные реакции, Положительные - с нингидрином и перманганютом калия, отрицательные - с хлоридом трехвалентного железа - Феррицианидом ка1003761 10 таллы отделяют, промывают небольшимколичеством 80-го (объем/объем) холодного водного раствора метанола,затем последовательно холодным метанолом и диэтиловым эфиром высушивают над пятиокисью фосфора при по"ниженном давлении и температуре60 С в течение 6 ч и добавляют0,930 ч. кристаллов, полученного антибиотика.Полученные кристаллы имеют следующие физико-химические свойства.гемпература плавления от 168 до 170 С.оНайдено, : С 35,51-35,56, Н 5,615,61, М 12,93-12,93," 5 7,45-7,59.С Н М 50 СНьОН0,5 НОВычислено, : С 35,69; Н 5,76;М 12,81, 5 7,33.Удельное вращение: Ы,т, + 82 ++ 5(С = 1,0, в воде).Инфра-красный спектр поглощения,доминантные пики (бромистый калйй),см г 3440, 3355, 3000, 1780, 1660,1650, 1538 1265, 1245, 1220, 1038,625,Спектрограмма ядерно-магнитногорезонанса (в диметилсульфоксиде,100 мГц); с, 3,31 ррах (5.3 Н) (определенный химический сдвиг в сторонуО-СН 6-6302).Д 3,320 ррщ (ВЯ) (определенныйхимический сдвиг в сторону -0-СНметанола, который содержится в кристаллах).,Антибиотик Си его натриеваясоль активны в отношении грамотрицательных и некоторых грамположительных бактерий (см. таблицУ). Антимикробный спектр 0-6302 и его натриевой солиМикроорганизм 25 25 25 25 12,5 12,5 25 25 12,5 12,5 100 100 100 100 25 25 100 100 лия, Сакагучи и Молиша; неопределенно положительные - реакция Эрлиха.Стоек в водном растворе в интеравале величин рН 3-7 при 60 С в течение 10 минутного нагревания, нестоек при величинах рН выше.8,5,П р и м е р 4, Клетки микроорганизма 0-6302, выращенного на питательном скошенном агаре, используютдля инокулирования питательной среды.0,5 полипептона, 0.,5 мясного экстракта и 0,5 хлористого натрия (рН7,0), затем колбу с инокулированнойсредой инкубируют на роторном встряхивателе при 28 С в течение 48 ч и 15получают посевную культуру.Конические колбы емкостью по200 об,ч. заполняют 40 об.ч. среды,содержащей 3 глицерина, 1 глюкозы,0,5 полипептона, 0,5 мясного экстракта и 0,5 хлористого натрия (рН7,0), добавляют в каждую колбу 0,020,5 различных соединений серы с последующим инкубированием на роторномвстряхивателе при 28 С в течение 96 ч,25Дополнительное введение соединенийсеры позволяет повысить выход антибиотика (от 15 мкг/мп на обычнойсреде до 20-80 мкг/мл при добавленииразличных серосодержащих соединений).З 0П р и м е р 5, В 7,5 об,ч, холодной воды растворяют 1 ч. антибиотикав свободной форме, затем в смесь добавляют 17,5 об.ч. холодного метанола. Смесь оставляют на холоде на 24 ч.Получают порошок, кристаллизованныйв виде бесцветных кристаллов. КрисЕсЬегсЬа со 1 МНЗЕьсЬегсЬа со 1 Т 5 а 1 щопе 11 а СурЬоаа ВохЬ 11 585 Ьдеа Г 1 ехпег ЕИ К 1 еЬве 11 а рпецпопае ОТРгосеия чи 1 дагя ГО 3988Ргойецв еогдап сГО 3168Р гог.ецио щ гаЬ 1 ьГО 38495 е ггас а ва гсея сепяГО 12648 Рьецдощопаа аегцдпоза 0-31 Минимальная ингибирующая концентрация мкгмл0-6302 и Са Свыше 100 Свыше 1001003761 12 Продолжение таблицы Минимальная ингибирующая концентрация.,мкг/млМикроорганиэм Си 0-6302 а 5 йарЬуососсць ацгець ЕОА 209 Р Свыше 100 Свыше 100 Свыше 100 Свыше 100 5 сгерсососсць руо 9 епев Е100 100 12,5 12,5 30 Формула изобретения 1. Способ получения антибиотикаСоставитель Г. СмирноваРедактор А, Ворович Техред А.Ач Корректор И. Ватрушкин а Заказ 1611/50 Тираж 521 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 Вас 111 ца вцЬй 11 в РСТ 219СогупеЬасйег 1 цв срЬгег 1 а ТогопоСапд 1 да а 1 Ьсдпд ЕО 05835 асСЬагощусеь сегеч 1 я 1 ае ЕО 0209Адрег 9111 цд п 19 ег ЕО 4066Репс 111 цщ сЬг 1 во 9 епца 1 ЕО 4626 Предлагаемый способ позволяет получить антибиотик, используемый для лечения заболеваний, вызванных перечисленными микроорганизмами, а также в качестве гермицида или дезинфицирующего средства. формулы МН Н Обн яо а-с-си -ь -с-и-сир ", ЙфзСвыше 100 Свыше 100 Свыше 100 Свыше 100 Свыше 100 Свыше 100 Свыше 100 Свыше 100 Заключающийся н том, что штамм Рвецдопопд 5 асеоорп 1 а САТССкультивируют в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли, с последующим отделением культуральной жидкости и выделением целевого продукта,2, Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, культивирование ведут на питательной среде, содержащей дополнительно мети онин, цистеин, цистин. сульфат натрия или тиосульфат натрия.