Рекомбинантная плазмидная днк -1 1-13, кодирующая синтез фибробластного интерферона ( i) человека, способ ее конструирования, штамм бактерий еsснеriснiа coli продуцент i-интерферона человека (original) (raw)
,Ж 1703692 А 1 РЕСПУБЛИК ИЕ ИЗОБРЕТЕ 1 Г ь(Р 1) ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ, ШТАММ БАКТЕ РИЙ Е 5 СНЕЙСНА СО- ПРОДУЦЕНТ Р -ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА(57) Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности. Цель - повышение уровня фибробластного интерферона (В 1) человека в клетках штамма-продуцента. Сконструирована рекомбинантная плазмида рРВ-Рй В 1-13, которая обеспечивает регулируемый синтез фибробластного интерферона человека в клетках Е.со под контролем промоторно-операторной области рвовбактериофага л. С помощью плазмиды рРВ-Рй /3 1-13 получен штамм Е,со ВНИИГенетика ч. 903 (рРЯ ЕЯ 1-.13), продуцирующий фибробластный интерферон в количестве 2 10 международных ед. интерферона на 1 л бактериальной культуры, что составляет около 106 от суммарного клеточного белка. 3 с,п. ф-лы. чивает экспрессию генлем регуляторной облфага А, состоит из бВамН 1-Вс 1 -фрагментды рРВ 124,модифицив ее состав олигонуклкера, и Есор-ЯаоЗА-фрМ р -Тгрдлиной 510Способ конструироной плазмиды рРЙ-РМв том, что В состав вмощью олигонуклеотидуникальный участок уэВ 9 , затем образующплазмиду рРВ 124 В расонными эндонуклеаза Й,ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ТОРСКОМУ СВИДЕТЕ(71) Всесоюзный научно-исследовательскийинститут генетики и селекции промышленных микроорганизмов(54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНА ДНК рРЯ-ГМ ф 1 - 13, КОДИРУЮЩАЯ СИ ТЕЗ ФИБРОБЛАСТНОГО ИНТЕРФЕРОН Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, молекулярной биологии и генно-инженерной биотехнологии и представляет собой сконструированную рекомбинантную плазмидную ДНК, обеспечивающую микробиологический синтез фибробластного интерферона человека, способ ее конструирования и штамм Е,со, содержащий эту рекомбинантную плаэмиду, - продуцент Р 1- интерферона человека.Целью изобретения является повышение уровня фибробластного интерферона человека в клетках штамма-продуцента.Новая плазмида рРВ-)Еч Д 1 - 13, которая имеет длину около 3.9 тыс,н.п., обеспе 2 й 15/23, С 12 Е 21/00, С 12 М 1/ а РМР) под контроасти рвов бактериоольшого ( 3,4 т.н,п) а векторной плазмированной введением еотидного В 9 -линрагмента плазмидын,п,вания рекомбинант- Р 1 - 13 заключается ектора рРк 124 с по- ного линкера вводят навания рестриктазы уюся таким образом щепляют рестрикцими Есой и В 9 и55 проводят соединение большего из образующихся фрагментов векторной молекулы с ЕсоЯ-ЯаоЗА-фрагментом, содержащим кодирующую часть зрелого уЗ -интерферона иэ плазмиды рЙД-тгр 7, в полученной таким образом рекомбинантной плаэмиде рРЯ Ей ф 1-123 проводят сближение 50-последовательности гена сго и первого кодона/3интерферона, для чего плазмидную ДНК гидролизуют рестриктазой ВавН 1, удаляют часть нуклеотидов с помощью экэонуклеазной активности ДНК-полимеразыЕ.со, расщепляют ДНК рестриктазой Есор, обрабатывают 3-эндонуклеазой с последующим полным восстановлением двуцепочечных концов с помощью Кленовского фрагмента ДНК-полимеразыЕ,со и обеспечивают циклизацию образовавшихся линейных молекул ДНК ДНК-лигазой фага Т 4, Полученным препаратом трансформируют клетки Е.со С.600, отбирают трансформанты на среде с ампициллином при культивировании клеток при 28 С с последующей селекцией на пониженную скорость роста при 42 С. Из отобранных таким образом клонов выделяют плазмидную ДНК,Штамм Е,со ВНИИгенетика Ч 4 903 (рРЯ-РЗЧ ф -13), регистрационный номер 1825, в коллекции культур микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиков - продуцент фибробластного (3 ) интерферона человека.Штамм получают трансформацией Е,со ВНИИгенетика Ч.903 (ВКПМ В) рекомбинантной плазмидой рРЯ-РМ,В -13 с последующим отбором рекомбинантных клонов на среде с ампициллином при 28 С и определением активности фибробластинтерферона в экстрактах клеток р нсформантов после дерепрессии Рвпромотора, достигаемой культивированием ш;ма в течение 1-12 ч при 42 С, В качестве реципиента могут быть также использованы штаммы Е,со С 600, Е,со ВНИИгенетика Ч 902 и другие производные Е.со К 12,Штамм Е.со ВНИИгенетика Ч 903 (рРЯРГ 4 ф -13) характеризуется следующими признаками.Морфологические признаки: клетки прямые, палочковидной формы (1,2 - 1,6) х х(2,0 - 6,0) мкм, слабоподвижные, способные к образованию нитевидных форм, грамотрицательные, неспороносные,Культуральные признаки, Клетки хорошо растут на плотных и жидких простых синтетических, полусинтетических и комплексных средах. При росте на агаризованном бульоне Хоттингера или -бульоне 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 образуют ослизненные, круглые, слабоматовые колонии. При выращивании в жидких средах типа-бульона или М 9 с казаминовыми кислотами образуют равномерную взвесь.Физиолого-биохимические признаки Клетки способны к росту в диапазоне 5- 40 С (оптимум 35 С) при рН 6,7 - 7,5. В качестве источника углерода используют аминокислоты и углеводы (например саха- розу), Источником азота могут служить минеральные соли в аммонийной форме. а также органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта и аминокислот.Устойчивость к антибиотикам. Штамм устойчив к ампициллину в концентрации до 100 мг/л при выращивании в жидких и на агаризованных питательных средах.Стабильность плазмиды, При хранении клеток на агаризованной среде (сроком до одного месяца), при серии последовательных пересевов (в течение не менее 6 месяцев) и в процессе глубинного культивирования в жидкой среде с антибиотиком не происходят потери и перестройки плазмиды,П р и м е р 1, Конструирование рекомбинантной плазмиды рРЯ-)Ечф -13.Рекомбинантную плазмиду рРЯ-(Еч /3 1- 13 получают в несколько этапов.Этап- конструирование векторной плазмиды рРЯ 124 В.3 мкг ДНК плазмиды рРЯ 124 расщепляют рестриктаэой ХЬа в 70 мкл буфера для рестрикции - , содержащего 10 мМ трис- НС, рН 7,9, 6 мМ М 9 С 2, 6 мМ 2-меркаптоэтанола, 150 мМ чаС, ДНК переосаждают двумя объектами этанола. Осадок растворяют в 15 мкл Н 20, Достройку одноцепочных 3-концевых участков ДНК проводят обработкой Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы Е.со в пробе объемом 20 мкл, содержащей 10 мМ трис-НС, рН 8,0, 10 мМ М 9 С 2, 2 мкг препарата ДНК, по 30 мкМ деэоксирубонуклеозидтрифосфатов, 5 ед. феомента, ДНК из реакционной смеси пере- осаждают этанолом и растворяют в 100 мкл НО,Воссоединение линеаризованной плазмидной ДНК с В 9 И-линкерами проводят при 16 С в течение 12 ч с помощью ДНК-лигазы фага Т 4 в пробе, содержащей буфер для лигиоования (60 мМ трис-НС рН 7,6, 10 мМ М 9 С 2, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,4 мМ АТФ), 2 мкг плаэмидной ДНК и 0,5 мкг линкеров. После проведения лигирования ДН К из реакционной смеси осаждают этанолом, растворяют и подвергают фер 1703692ментативному гпдролизу рестриктазой Вд в пробе объемом 40 мкл, содержащей буфер для рестрикции - 2 (6 мМ трис-НС рН 7,6, 6 мМ М 9 С 2, 6 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 мМ МаС), ДНК вновь осаждают этанолом, растворяют, 1 мкг препарата плазмидной ДНК в 240 мкл буфера для лигирования обрабатывают ДНК-лигазой Т 4, Полученной смесью трансформируют клетки Е.со С 600,Эффективность трансформации составляет до 5 10 колоний на 1 мкг нативной плазмиды рРЯ 124, Отбирают клоны, устойчивые к ампициллину (100 мкг/мл), из них выделяют плазмидную ДН К и используют ее для рестрикционного анализа, В результате получают плазмиду рРЯ 124 В, которая в отличии от исходной векторной молекулы рРЯ 124 содержит уникальный участок расщепления Вдг вместо имевшейся последовательности узнавания.Этап 2 - конструирование промежуточной плазмиды рРЯ-Ю Р -123,В состав вектора рРЯ 124 В интегрируют кодирующую последовательность фибробластного интерферона человека из плазмиды р 14,8-игр, Для этого 10 мкг ДН К р)ч Дгробрабатывают совместно рестриктазами Е,соЯ и ЯацЗА в пробе объемом 100 мкл, содержащей буфер для рестрикции - 2, Полученный препарат наносят на гель 1 1 ф- ной легкоплавкой агарозы и подвергают электрофорезу в трис-ацетатной буферной системе, Полоску геля, содержащую фрагмент ДНК длиной 510 н.пвырезают и ДНК элюируют из геля,Полученный таким образом фрагмент ДНК ( 1 мкг) интегрируют.в плазмиду рРЯ 124 В. Для чего 1 мкг ДНК рРЯ 124 В расщепляют рестриктазами ЕсоЯ и Вдй в пробе объемом 20 мкл в буфере для рестрикции - 2, Полученный препарат подвергают фенольной депротеинизации, ДН К осаждают этанолом и растворяют в 10 мкл Н 20 0,5 мкг ДНК расщепленной плазмиды рРЯ 124 В объединяют с 1 мкг выделенного фрагмента плазмиды рИ 3-тгри обрабатывают ДНК-лигазой Т 4 в пробе объемом 30 мкл, в буфере для лигирования. Полученным препаратом ДНК проводят трасформацию клеток Е.со С 600 с отбором трансформантов на среде с ампициллином с последующей селекцией Св -клонов на среде с 200 мкг/мл хлорамфеникола при культивировании клеток при 42 С.Из отобранных таким образом клонов выделяют плазмидную ДНК и исследуют с помощью рестрикционного анализа, В полученной плазмиде Е.соЯ - Вд-фрагмент,5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 кодирующий С-концевую часть хлорамфениколацетилтрансферазы в составе вектора рРЯ 124 В, замещен на кодирующую последовательность зрелого /3 -интерферона человека, Данная плазмида обозначена р РЯ- ГМ /3 -123.Этап 3 - конструирование плазмиды рРЯ-РМ ф13,30 мкг ДНК плазмиды рРЯ-Рч 3 -123 расщепляют рестриктазой ВагпН в 150 мкл буфера для рестрикции - 1, ДНК подвергают фенольной депротеинизации и осаждают этанолом. Осадок растворяют в 40 мкл Н 20, Для ограниченной деградации ДНК с помощью Зф -5 экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы 1 Е,со полученный препарат ДНК инкубируют в пробе объемом 150 мкл содержащей 50 мМ трис-НС, рН 8,0, 10 М ЭДТА; 5 мМ МдС 2, 100 мкМ ДАТФ, а затем дГТФ и 20 ед. ДНК-полимеразы, Реакцию останавливают, проводят переосаждение ДНК и осадок вновь растворяют в 40 мкл Н 20. 10 мкг полученного препарата обрабатывают рестриктазой Е,соЯ в 50 мкл буфера для рестрикции - 2, проводят фенольную депротеинизацию, осаждение ДНК этанолом и растворяют осадок в 30 мкл.Удаление однонитевьх концевых участ ков полученного препарата ДНК проводят при помощи эндонуклеазы 1 в пробе объемом 100 мкл, содержащей 30 мМ СНзСООча, рН 4,4, 4,5 мМ 2 п 504, 250 мМ МаС, 10 мкг ДНК, 200 ед. 5-эндонуклеазы. Реакцию проводят при 20 С, после чего смесь подвергают фенольной обработке и переосаждению нуклеиновой кислоты этанолом. Осадок растворяют в 20 мкл -20, 4 мкг полученного таким образом препарата ДНК обрабатывают Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы 1 Е.со в указанных условиях для достройки возможно имеющихся одноцепочечных концов молекул до двухцепочечных. Реакцию останавливают фенольной депротеинизацией, нуклеиновые кислоты осаждают этанолом и растворяют в 20 мкл Н 20,Лигирование линейных молекул ДНК с двуцепочечными концами проводят при 16 С в пробе объемом 50 мкл, содержащей 60 мМ трис-НС, рН 7,6, 10 мМ М 9 С 2, 10 мМ дитиотреитол, 4 мМ АТФ, 8 -ный полиэтиленгликоль - 6000, 4 мкг ДНК, 100 ед, ДНК- лигазы Т 4. После завершения реакции пробу разбавляют водой в четыре раза и проводят осаждение нуклеиновых кислот этанолом, 2 мкг растворенной в Н 20 ДНК обрабатывают рестриктазой В 95 в 30 мкл буфера для рестрикции - 2. ДНК осаждаютиз реакционной смеси этанолом, растворяют в воде и обрабатывают ДНК-лигазой Т 4 в 200 мкл буфера для лигирования.Полученный препарат ДНК используют для трансформации клеток Е.со С 600 указанным образом с последующей селекцией трансформантов на среде с ампициллином при культивировании клеток в течение суток при 28 С. Среди полученных трансформантов отбирают варианты, обладающие пониженной способностью к росту при 42 С. Из указанных клонов выделяют плазмидную ДНК, указанным образом и подвергают рестрикционному анализу,Для установления первичной структуры гибридного участка связывания рибосом перед геном 1 ГЙ ф 1 в полученной плазмиде рРЯ- Гйо -13 30 мкг соответствуЮщей ДН К обрабатывают рестриктазой Нпб 11 в 100 мкл буфера для рестрикции - 2, наносят на градиентный (4-12) полиакриламидный гель. Электрофореэ проводят в трис-ацетатной буферной системе,Фрагмент ДНК длинойн,п. элюируют из геля по методу Максама-Гилберта, к нему присоединяют с помощью ДНК-лигазы Т 4 ВагпН 1-линкеры "СааЬога 1 че ВеэеагсЬ" (США) аналогично указан ному способу. ДН К переосэждают этанолом, осадок растворяют в 20 мкл Н 20, расщепляют рестриктаэой ВагпН в 30 мкл буфера для рестрикции - 1, депротеинизируют фенолом, осаждают этанолом и растворяют в НгО.Молекулярное клонирование образующегося при расщеплении ВагпН фрагмента ДНК в составе репликативной формы ДНК бактериофага М 13 гпр 10, селекция рекомбинантных фагов на индикаторной среде, содержащей 5-бром-хлор-индолил- ф -0-галактоэид (Ха), выделение одноцепочечной фаговой ДНК и определение первичной структуры клонированного фрагмента с помощью метода ограниченного матричного копирования (метод Ф,Сенгера) осуществляется в соответствии с хорошо разработанными стандартными методами. Установленная методом Сенгера нуклеотидная последовательность гибридного участка связывания рибосом в составе плазмиды рРЯ-ГЧ ф 1-13 является следующей; 5 -ТААООАОСТТООАТО-З, где ТАА(3 САОСТ - Ю-последовательность гена сго фага А, а АТО - метиониновый кодон ф -интерферона. П р и м е р 2, Получение штамма Е.со ВНИИгенетика ЧЬ. 903 (рРВ-ГМ ф 1-13) - продуцента фибробластного интерферона человека,5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Плазмиду рРЯ-ГМ /3 -13, кодирующую синтез фибробластного интерферона человека, трансформацией вводят в клетки штамма Е.со( ВНИИгенетика И 903 из коллекции ВНИИгенетика (регистрационный номер ВКПМ Вво Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов). Эффективность грансформации клеток Е со ВНИИгенетика Ч 903 составляет около 10 клонов на 1 мкг нативной ДН К плазмиды рРВ- Гч В)-13. Трансформанты отбирают на среде, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), после культивирования клеток в течение суток при 28 С. Из отобранных клонов выделяют плазмидную ДНК и подтверждают ее идентичность препарату ДН К рРВ-Гйф -13 с помощью рестрикционного анализа. Полученный штамм Е,со ВНИИгенетика Ч 903 (рРВ-Гй В -13) депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов,П р и м е р 3. Определение продуктивности штамма Е.со В Н И И генетика И 903 (рРВ.Гч ф 1-13) - продуцента фибробластного интерферона человека,Для определения продуктивности штамма Е,со ВНИИгенетика И 903 (рРЯ- ГЧ ф -13) плазмидсодержащие клетки выращивают при 28 С на скошенной агаризованной стандартной среде Хоттингера, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, в течение 14 ч, Выросшую на косяках биомассу используют для получения посевного материала, Для этого клетки переносят в колбы Эрленмейера объемом 750 мл со 100 мл среды Хоттингера, со 100 мкг/мл ампициллина и выращивают при 28 С на качалке при 240 об/мин в течение 6 ч, Оптическая плотность посевной культуры составляет 1,5-2,5 ед.Ферментацию проводят в ферментере, оснащенном системами для регулирования рН, температуры, скорости перемешивания и аэрации. Для ферментации используют среду Хоттингера со 100 мкг/мл ампициллина и 10 г/л глюкозы. Посевную культуру внося в количестве 5 - 10 . Культивирование осуществляют при рН 6,6-6,8, поддерживая этот уровень подачей аммиачной воды, Первую часть ферментации до О, Дыо = 3,5 проводят при 28 С, а затем осуществляют термоиндукцию, повышая температуру до 42 - 45 С в течение 5 мин, после чего продолжают ферментацию еще 2 ч при той же гемпературе.После окончания процесса для определения активности интерферона клетки из 1 мл культуральной жидкости осаждают центрифугированием, осадок ресуспендируют в1 мл 1-ного раствора додецилсульфата натрия в 0,02 М фосфатном буфере, рН 7,2, содержащем 1% 2-меркаптоэтанола, и прогревают 2-4 мин при 100 С. После этого осадок отбрасывают центрифугированием и активность интерферона, содержащегося в надосадочной фракции; определяют стандартными методами или по защите диплоидных фибробластов человека от цитопатического действия вируса веэикулярного стоматита, или методами иммуноферментного анализа. В качестве стандартов используют препараты Р -интерферона ("Тогеу", Япония), оттитрованные по стандарту лейкоцитарного интерферона МРСВ 69/19 (Великобритания) или Р 9 (СССР).По различным методам определения активность фибробластного интерферона человека, синтезируемого в клетках штамма Е.со 1 ВНИИгенетика ч 903 (рРЯЕМ р), составляет более 2 10 международных9ед./л бактериальной культуры,Для определения доли синтезированного фибробластного интерферона от суммарного клеточного белка клетки из 1 мл культуральной жидкости осаждают центрифугированием и обрабатывают указанным образом, препарат разделяют электрофорезом в присутствии 0,10 додецилсул ьфата натрия в 15%-ном полиакриламидном геле. Белки, разделенные в полиакриламидном геле, прокрашивают в растворе Кумасси Р. Количественное содержание белков в зонах определяют после сканирования геля на автоматическом лазерном денситометре "КВ 2202" фирмы "КВ" (Швеция), Идентификацию зоны, соответствующей синтезированному в клетках зрелому фибробластному интерферону (19 кД), проводят на основе сравнения с электрофоретической подвижностью маркерных белков, а также с помощью иммуноблотинга разделенных белковых фракций на нитроцеллюлозные фильтры и идентификации зоны интерферона с помощью обработки фильтров в растворах, содержащих мышиные моноклональные антитела против -интерферона и антимышиные кроличьи антитела, коньюгированные с пероксидаэой из хрена. После соответствующей процедуры окрашивания зона интерферона выглядит темной полосой коричневого цвета на неокрашенном фоне нитроцеллюлозного фильтра.Содержание белка в зоне, соответствующей 3 1-интерферону. составляет около 100 от суммарного белка плазмидсодержащих клеток Е,со 1 ВНИИгенетика Ч 903 (рРКЕ 1 ф 1-13) 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Таким образом, изобретение в условиях крупномасштабного культивирования клеток ЕэсЬегсна со 1 позволяет достичь выхода более 2 х 10 ед./л, что соответствует 5 - 10% от общего клеточного белка,Формула изобретения 1, Рекомбинантная плазмидная ДНК рРВЕМР 1-13, кодируюЧая синтез фибробластного интерферонар 0) человека, длиной около 3,9 тыс,н.п., содержащаяВавН 1-Вд 1-фрагмент векторной плазмиды рРЯ 124 (размером 3,4 т,н.п.), модифицированный введением в ее состав олигонуклеидного Вд 11 линкера, Есой- ЯапЗА-фрагмент длиной 510 н.п, плазмиды рй Р -тчр 7, который содержит участок ответственный за инициацию репликации и се регуляцию, - Со 1 Е 1-репликон (оч Со ЕО,ген репрессора с 1 тЯ 857 фага )., ген устойчивости к ампициллину (Ар), Тандем р -независимых терминаторов транскрипции фага 1 с 1 фб),регуляторную область (РвОв),0-последовательность гена сго (ЯОсго), кодирующую последовательность зрелого фибробластного интерферона человека (Ей 1 о 1) с собственным метиониновым кодоном (1-Ме 1),соединение регуляторной области гена сго 1, кодирующей части Р 1-интерферона и терминаторов транскрипции 1 б, которое осуществлено так, что перед геном 1 ЕМ р 1 образован гибридный участок связывания рибосом, имеющий следующую нукР леотидную последовательность: 5 - ТААООАООТТООАТО -3, где ТААООАООТ - ЯО-последовательность гена сго фага, АТО - метиониновый кодон интерферона, а непосредственно за терминирующим кодоном гена 1 Ей 1 э" 1 расположен тандем р -независимых терминаторов транскрипции фага 1 б,уникальные участки узнавания рестриктаз с а 1, координата которого является началом отсчета (0, Рчн(-1110), ВдЕ. (-1 180), Асе -1 870), Рчн Я 360).2, Способ конструирования рекомбинантной плазмиды рРЯ-ЧЕМР 1-13, заключающийся в том. что в состав рРВ 124 с помощью олигонуклеотидного линкера вводят уникальный участок узнавания рестриктазы Вд 01, в результате получают плазмиду рРВ 124 В, которую затем расщепляют рестрикционными эндонуклеазами Есо 1 ц и Вд 11, проводят соединение большего из образующихся фрагментов векторной молекулы с Есой 1-ЯанЗА фрагментом плаэмиды р 1 Ч р -сгр 7, содержащим кодирующую1703692 12 Составитель Т, ЗабойкинаТехред М,Моргентал Корректор Т, Малец Редактор И. Шулла Заказ 40 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 часть зрелого ф)-интерферона, в полученной таким образом рекомбинантной плазмиде проводят сближение ЯО-последовательности гена сго и первого (метионинового) кодона 3 -интерферона, для чего плазмидную ДНК гидролизуют рестриктазой ВапН, удаляют часть нуклеотидов с помощью зкзонуклеазной активности ДНК- полимеразы , проявляющейся в условиях неполного набора нуклеозидтрифосфатов в реакционной смеси, ферментативно расщепляют ДНК рестриктазой Есой. обрабатывают Я-зндонуклеазой для удаления одноцепочечных участков ДН К и последующего полного восстановления двуцепочечных концов с помощью Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы Е,со и обеспечивают циклизацию образующихся линейных молекул ДНК ДНК-лигазой фага Т 4, полученным таким образом препаратом 5 трансформируют клетки Е,со С 600 с отбором трансформантов на среде с ампициллином при культивировании клеток при 28 С с последующей селекцией клонов, обладающих пониженной скоростью роста при 10 42 С, после чего из отобранных клонов выделяют рекомбинантную плазмидную ДНК рРЙ- ЕМ ф )-13.3. Штамм бактерий Евспегста соВНИИА 1825 - продуцент фибробластно го ф ) интерферона человека,