Способ получения таннина листьев суммаха, обладающего интерферониндуцирующей активностью — SU 1733436 (original) (raw)

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 3436 А 1)5 С 07 Н 13/02 ГОСУДАРСТВЕННЫЙПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР ИТЕТКРЫТИЯМ С)ПИСА К АВТОРСКОМ ТЕН ЗС)Б ИДЕТЕЛ ЬСТВУ(71) Институт биоорганической химииим.акад.А.С,Садыкова и Институт ботаникиАН УЗССР(56) Садыков А.С., Ершов Ф,ИНовохатскийА,САсланов Х,А., Ауелбеков С.А, Индукторы интерферона. Ташкент, ФАН, 1978,с,207 в 2.Авторское свидетельство СССРВ 721103, кл, А 61 К 45/02, 1977,Природные полифенолы и их производные - противовирусные препараты и индукторы интерферона, Сб. Ташкент, ФАН, 1981,с.3 - 29, 49 - 55,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТАН НИНА ЛИС ТЪЕВ СУМАХА, ОБЛАДАЮЩЕГО ИНТЕР ФЕРОНИНДУЦИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ Изобретение относится к области медицины, а именно к вирусологии, и может быть использовано в качестве индуктора интерферона,Известными индукторами интерферона являются синтетические полинуклеотиды и вирусы.Однако эти препараты дорогостоящие и обладают антигенной активностью,Госсипол тоже обладает интерферониндуцирующим действием в культуре фибробластов эмбрионов кур и в организме экспериментальных животных.(57) Изобретение касается производных сахаров, в частности получения таннина листьев сумаха, обладающего интерферониндуцирующей активностью. Цель - повышение активности и снижение токсичности целевого продукта с приданием ему водорастворимых свойств. Процесс ведут экстракцией листьев сумаха вида Юоз даЬга, Рпцз турЫпа или Рпцз согага 700-ным водным раствором ацетона при 50-55 С с последующим концентрированием экстракта 3-кратной обработкой концентрата сначала хлороформом, взятым в 3-кратном объемном избытке, затем пятикратно этилацетатом, взятым в 3-кратном избытке, высушиванием безводным Ка 2504 (22 - 24 ч), концентрированием под вакуумом при 38 - 40 С, осаждением гексаном или петролейным эфиром, взятым в 4-кратном избытке, высушиванием под вакуумом при 45 - 50 С.(5 ч) и хроматографической очисткой на силикагеле. Полученный продукт по активности и токсичности лучше госсипола (в дозе 100 мкг/мл новый продукт не оказывает воздействия на культуру клеток в течение 24 ч), 8 табл,Сравнительно высокую интерферониндуцирующую активность в культурах клеток первично трипсинтезированных фибробластов человека, лейкоцитах донорской крови человека проявляет мегосин - производное госсипола (госсипол-/3-аминоэтилсернокис- лый натрий).Основным недостатком как госсипола, так и мегосина с точки зрения использования их в качестве индукторов интерферона является то, что они продуцируют интерферон 1 и мачо только при интраперитонеальном введении, Кроме того, госсипол и1733436 робластов мыши :929, диплоидные клетки фибробластов эмбриона человека Ми мегосин токсичны и их химико-терапевтиче. ский индекс значительно ниже такового предлагаемого вещества, Использование мегосина в качестве индуктора человеческого лейкоцитарного интерферона в больших масштабах препятствует нехватка донорской крови,Цель изобретения - создание эффективного ьодорастворимого малотоксичного и относительно дешевого индуктора интерферона из растительного сырья, обладающего этим видом активности как при парентеральном, так и пероральном введеПоставленная цель достигается использованием таннина листьев любого из трех видов сумаха (КЬоз 9 аЬга, ВЬлурЬпа, КЬ,согапа), получаемого экстрагированием листьев 70-ным водным ацетоном при 50 - 55 С с последующей выпариванием водноацетонового экстракта, 3-кратной обработкой водного остатка сначала хлороформом в соотношении 1:3, затем этилацетатом (5 раз) в том же соотношении, высушиванием этилацетатной вытяжки свежепрокаленным сернокислым натрием в течение 22-24 ч, концентрированием высушенной и отфильтрованной этилацетатной вытяжки под вакуумом при 38 - 40 С до небольшого объема и осаждением таннина 4-кратным объемом гексана или петролейного эфира, Отфильтрованный осадок, представляющий собой таннин в смеси с другими полифенолами, промывают гексаном или петролейным эфиром и высушивают в вакуум-сушильном шкафу при 45-50 С а течение 5 ч, Выход составляет 11 - 13 от воздушно-сухой массы, Полученный таннин для очистки от сопутствующих полифенолов хроматографируют на колонке с силикагелем.Проведение сравнительное изучение интерферониндуцирующей активности таннина листьев сумаха, госсипола и мегосина (табл.1), а также их токсического и цитотоксического действия (табл. 2 и 3), Так как таннин листьев сумаха хорошо растворим в воде (госсипол и мегосин в воде не растворимы). при исследовании на животных его растворяли в физиологическом растворе, а при проведении экспериментов с культурами ткани - .в питательной среде.Изучение интерферониндуцирующей активности предлагаемого препарата проводили на культурах клеток различного происхождения, так как известно, что различные культуры клеток проявляют неодинаковую способность к продукции интерлимфоцитарные культуры периферической крови человека.Как видно из табл. 1, предлагаемый препарат является высокоактивным индуктором интерферона как на культурах фибробластного типа, так и в лимфоцитах крови человека, и его активность значительно выше активности госсипола.По приведенным данным видно, что таннин сумаха оказался нетоксичным при 510 максимально растворимых дозах, в то время как прототип оказался токсичным вдозе 100 мг/кг. Из табл. 3 видно, что для-клеток сравнительно менее токсичным оказался предлагаемый препарат, который даже в дозе 100 мкг/мл не оказывал заметного воздействия на культуру клеток в течение 24 ч,20 Для установления оптимальных условий экстракции (концентрация ацетона в экстрагенте, температура) были взяты навески по 20 г. Определение выхода таннина проводили по известной методике.Результаты приведены в табл. 4.Установлено, что наиболее оптимально соотношение водный концентрат;хлороформ 3:1. При соотношении 4;1 извлечение липофильных веществ неполное, что в даль 25 30 нейшем приводит к осмолению экстракта при осаждении, Соотношение водный концентрат;хлороформ 1;1 или 2:1 не дает существенного улучшения качества водного концентрата при значительных затратах хлороформа.Двухкратная обработка хлороформом водного концентрата не позволяет полностью освободиться от сопутствующих веществ, а проведение четырехкратной обработки излишне, наиболее оптимальным является проведение трехкратной обработки,Данные зависимости выхода таннина от кратности обработки и соотношения этилацетата к водному остатку приведены в табл. 5.Установлено, что наиболее оптимальным временем высушивания этилацетатной вытяжки. безводным сернокислым натрием является 22 - 24 ч, При меньшем промежутке времени в этилацетатной вытяжке сохраняются следы влаги, и конечный продукт не 35 40 45 50 осаждается при обработке петролейным эфиром или гексаном, более продолжительное высушивание этилацетатной вытяжки сернокислым натрием излишне,Выявлено, что концентрирование эти 55 ферона, Были использованы перевиваемые лацетатной вытяжки лучше проводить при линии клеток трансформированных фиб - 40 С,таккакболеевысокаятемператураоприводит к изменению конечного продукта, а при более низких температурах затягивается время перегонки, что также приводит к нежелательным изменениям продукта (гидролизу),Данные о зависимости полноты осаждения таннина от соотношения этилацетатного концентрата и петролейного эфира (гексана) приведены в табл.6.Установлено, что оптимальными условиями высушивания конечного продукта является сушка его под вакуумом при 45 - 50 С в течение 5 ч, Более высокая температура приводит к разложению таннина, а проведение высушивания менее 5 ч недостаточно для полного высушивания,П р и м е р 1, Получение таннина.1 кг воздушно-сухих листьев растения четырехкратно экстрагируют 70)-ным водным ацетоном противоточным способом (модуль 1:10) при 50 С. Полученные экстракты объединяют, ацетон отгоняют под вакуумом при 40 С. Водный концентрат обрабатывают в делительной воронке 3 раза хлороформом в объемном соотношении водный концентрат:хлороформ 3;1, затем водный концентрат обрабатывают 5 раз этилацетатом в том же соотношении, Этилацетатные вытяжки объединяют, сушат свежепрокаленным сернокислым натрием (на 1 л вытяжки 200 г соли) в течение 22 ч, Затем этилацетатную вытяжку фильтруют, этилацетат отгоняют под вакуумом при 38 С до помутнения раствора и появления светлого налета на стенках колбы и осаждают таннин в смеси с другими фенольными соединениями 4-кратным объемом гексана или петролейного эфира, Осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера, промывают 500 мл гексана или петролейного эфира и высушивают в вакуум-сушильном шкафу при 45 С в течение 5 ч, Выход препарата (110 г) составляет 11 от веса сырья. Полученный препарат очищают от сопутствующих фенольных соединений с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, Выход очищенного таннина (62,0 г) составляет 56 от веса исходного препарата.Полученный препарат таннина представляет собой аморфный порошок светло- кремового цвета, хорошо растворим в воде, спирте,метаноле, ацетоне, ДМСО, ДМФА, растворим в этилацетате, плохо растворим в диэтиловом эфире, не растворим в хлороформе, гексане, петролейном эфире, Ю 0,53 (ХБ "Е 11 гаК", система растворителей н.бутанол - уксусная кислота - вода 40:12:28);Уф-спектр (метанол, 0,01) 217,280 нм; спектр ПМР снят на приборе Х - 200 "Чапап" с рабочей частотой 200 МГц: широ кий бесструктурный синглет при 8,43 м.д. принадлежит протонам фенольных групп; ароматические протоны остатков галловой кислоты резонируют в области 6,9 - 7,7 м,д. в виде набора узких сигналов; при 6,36, 6,05, 5,68 и в области 4,25 - 4,70 м,д. с интегральным отношением 1;1:2:3 соответственно расположены сигналы протонов сахарного остатка О-глюкозы, Исходя из интегральной кривой, на один сахарный остаток приходится семь остатков галловой кислоты. Из 10 низкопольного расположения сигналов протонов сахарного остатка следует, что все гидроксильные группы О-глюкозы замещены и, следовательно, в молекуле таннина присутствуют два дигалловых остатка, причем их место присоединения предпочти 15 тельнее в положениях 2 и 4 или 3 и 5 П р и м е р 2. Аналогичен примеру 1, нотемпература экстракции 53 С, температура 20 концентрирования водно-ацетонового экстракта - 43 С, время высушивания этилацетатной вытяжки 23 ч, температура концентрирования этилацетатной вытяжки 39 С, температура высушивания таннина 48 С. Выход таннина 69,5 г,П р и м е р 3. Аналогичен примеру 1, но температура экстракции 55 С, температура концентрирования водно-ацетонового экстракта 45 С, время высушивания этилацетатной вытяжки 24 ч, температура концентрирования этилацетатной вытяжки 40 С, температура высушивания таннина 50 С, Выход таннина 78 г,П р и м е р 4, Определение интерферониндуцирующей активности таннина сумаха (1 и чего),К монослоям клеток-929, выращенным при 37 С на 96-луночных панелях под стан- дартным парциальным давлением С 02(5 ), добавляли в различных концентрациях раствор таннина сумаха, После 3-часового контакта с препаратом клетки двухкратно обмывали раствором Хенкса и добавляли 100 мл питательной среды, содержащей 2% бычьей сыворотки,Титры интерферона в культуральной жидкости определяли через 24 ч по подавлению цитопатического действия (ЦПД) текст-вируса (ЕМС) энцефаломиокардита мышей микрометодом на гомологичных культурах.Данные представлены в табл. 7,25 30 35 40 45 50 55 Специфичность интерферона подтверждали определением его термолабильности (прогревание в течение 30 мин при 56 С), кислотоустойчивости и чувствительности к обработке трипсином (0,2 мл 0,25,-ного раствора в течение 30 мин при 37 С),1733436 Таблица 1 ндуктооы интерферона жаннин сумэх итд И оза, м 048 640 640 Н ис ле+" - с доба влени ТИ оза, мг/кг Выживаемость, 1 10040 100 200 100 200 400 800 1600МегосинТаннин сумаха 0 10 10 10 10 10 ца нтенсивность действи75 100 П р и м е р 5. Определение интерферониндуцирующей активности таннина сумаха на белых беспородных мышах (п чача),Белым беспородным мышам (вес 10- 12 г) перорально и внутрибрюшинно вводили и репарат в различных кон центра циях. Для сравнения использовали препараты госсипола и мегосина, Титры интерферона определяли в сыворотке крови мышей через 48 ч после введения препарата, Данные приведены в табл. 8,Таким образом, предлагаемый способ дает возможность получения таннина сумаха с высокой интерферониндуцирующей ативностью при значительно меньшей по сравнению с госсиполом и мегосином токсичностью п арво и и чего, Кроме того, таннин сумаха в отличие от госсипола и мегосина хорошо растворим в воде, что позволяет вводит его животным как парентерально, так и перорально.Формула изобретения Способ получения таннина листьев сумаха, обладающего интерферониндицирующей активностью, отл ич а ю щи й ся тем, что, с целью повышения активности и снижения токсичности и придания водорастворимых свойств, листья сумаха вида Вшз 5 даЬга; Раааа турЫпа или ВЬцз сог 1 ага экстрагируют 70 О/,-ным водным раствором ацентона при 50 - 55 С, экстракт концентрируют, водный концентрат обрабатывают трехкратно хролоформом в объемном сост ношении хлороформ: водный .концентрат1;3, затем пятикратно этилацетатом в объемном соотношении этилацетат: водный концентрат 1:3, высушивают этилацетатнуа вытяжку безводным сернокислым на трием в течение 22 - 24 ч, концентрируют иод вакуумом и ри 3840 С, осаждают гексаном или петролейным эфиром при объемном соотношении экстракт;гексан или петролейный эфир 1,4, высушивают под вакуумом при 45- 50 С в течение 5 ч и очищают целевой продукт с помощью колоночнай хромгтогра 4 ии на силикагеле.1733436 12 Продолжение табл.7 ДЭАЭ - декстран добавляли в соотношении озе индуктора интерфер аблица 8 Составитель Н. НарышковаРедактор Л. Веселовская Техред М,Моргентал Корректор Н, Король роизводственно-издательский комбинат "Патент", г; Ужгород, ул.Гагарина, 101 каз 1638 ВНИИП м е ч а н и е, На каждую точку брали по 5 мышей,Тираж Подписноедарственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ С 113035. Москва, Ж, Раушская наб 4/5

Смотреть

Способ получения таннина листьев суммаха, обладающего интерферониндуцирующей активностью