Способ получения 4 -дезокси-13(s)-дигидро-4 йододоксорубицина — SU 1760986 (original) (raw)

(19) САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АТЕНТУ Изобретение относ гической промышленно изводству антибиотикоДля осуществления ют штамм Зтгерогпусез Штамм получен селекц вия на исходный штамм да аоге 0 з АТСС 31428 Штамм зарегистрировномером ОЯМ 2444 вмикроорганизмов, ЗапаШтамм применяютного восстановления фпы кетона в 13-полож для стереоселективнкциональной групении 4-дезоксически 4-дезоксирубицина, одного из с получением специ Я)дигидро-йодокс-йододоксорубицина: ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯРИ ГКНТ СССР(71) Фармиталиа Карло Эрба С,р.л. (Щ(57) Использование: микробиологическаяпромышленность, производство антибиотиков, Сущность изобретения; для получения4-дезокси(Я)-ди гидро-йододоксорубицина используют штамм Ятгер 1 овусезрецсе 11 оз 05 М 2444. Последний выращивают при 27 - 30 С в течение 3 - 5 дней в жидкойпитательной среде, содержащей источникиазота и углерода и минеральные соли, в приится к микробиолости, в частности пров.способа используреисетоз М 87 Р.1. ией путем воздейст. ревсе 1 цз подвинитрозогуанидином. ан под каталожным немецкой коллекции дная Германия.(5)5 С 12 Р 1/06//(С 12 Р 1/06, С 12 й 1:465) сутствии 4-диокси-Глододоксирубицина в форме его хлоргидрата в конечной концентрации 0,1 мг/мл среды. Полученную культуральную жидкость разделяют, и отдсленный мицелий экстрагируют ацетоном. Жидкую Фазу экстрагируют смесью дихлорметана и метанола в обьемном соотношении 9:1 при рН 8,0. Полученные экстракты объединяют и концентрируют при пониженном давлении до сухого состояния. Затем концентрат растворяют в дихлорметане и хроматографируют на колонке из силикагеля, забуференного до рН 7,0. Целевой прсдукт элюируют последовательно смесью дихлорметана, метанола и воды при объемном соотношении 95:5:0,25 и 90:10:0,5. Второй элюат концентрируют в присутствии Н-пропанола, выделяют целевой продукт и переводят в форму его хлоргидрата, 1 з,п, ф-лы, 2 табл, 1760986двух возможных при Сстереоизомерных 4-деза кси-ди гидро-иододо ксорубиц иное. Новое соединение формулы . называемое далее как ГСЕ 24883, является полезным в качестве противоопухолевого 5 средства и проявляет активность на экспериментальных опухолях, сравнимую с активностью 4-дезокса-1 ладодоксорубицина формулы , Субстратом для микробного стереоселективнога восстановления яв ляется палусинтетический аналог даксорубицина, Получают целевой продукт формулы :О ОН О :; .И,Г, О 11 1 Ъ;. 1 О ОИ р20 ,Г1-1,)Морфология мутантаго шта.:.м 11 М 87 Г,1. Г Отли 1 дется ат таковой ма)ери 1:ского н,:тамма 8 Г висел 11 э АТОС 31428, в та вре 1 п к к Обе культуры четка различаю)с: па сво.1)л 1:ультуааль 1:1 м и биохимическим харак 3. 1 ерист 11 кдм, Так, му 1 ангный штамм .187 Г-, . 11 е 11 радуц 11 рует нд дгдравай среде ат соло;1 е 1,1)-)к(,лтаго да лима 11 а-желтого рд. Гва ОимаГО пиГментд, катарыЙ явля,тся характерным для материнского штд;л 1 лд Я, 35 реасеОз АТСС 31428.раме того, мутантный шта 1 л 1 л М 87 Г.1. мажет избирательно превращать соединениев соединение , агда кдк магеринский штамм Я, рецсетОз А 1 СС 3 428 не 40 избирателен в зтам Оташении. 3 та свойство 1 лутанта М 87 Г 1 делде Г ага выс1, О полезным, как описано в заявке,Стереаизбирательнае биапреабраэавание 11)же быть Ос) ществлена 1 д. множа к)щейся 1.уль 1 ура 3. реисе 1 оэ ш 1 дмм Ы 87 Г,1. при добавлении соединения 1) в качестве субстрата в культурдл 1,ую среду в инкубацнаннам периодеСоединение 11) мажет быть,1 ллеО Р 50 ФОРМ,. ГИДРОХЛОРИДа ПГ)СЛГ 1 С)П 1 О :1 1, 1.1,1,И в стерильнаЙ дистиллиравднн 1)и ваде. уль" туру выращивают в питательной среде, содержащей источник углерода, например усваивдемый углевод, и исто 1 ик аза)а, т.е. 55 усваиваемае соединение азота или белковый материал, Предпочтительные исга 1 ики углерода включают глюкозу, сахдразу, глицерал, крахмал, кукурузный крахмал, декстрин, мелассу и тому подобные. Предпачтительные источники азота включают настой от замачивания зерна, дрожжевой экстракт, пивные дрожжи, саеву 1 о муку, муку из семян хлопка, кукурузную муку, казеин, рыбную муку, сухие остатки дистилляции, животный пептон, мясной экстракт, соли аммония и др, Может быть выгодно испол ьзовано сочетание таких источников углерода и азота.Процесс биопревращения можетдлиться примерно от 72 часов да 8 дней, Инкубационная температура в процессе биопревращения может быть в интервале примерно от 25 Сдо 37 С, предпочтительноо29 С. Содержимое бродильных сосудов аэрируют взбалтыванием при 250 оборотах в минуту или перемешиванием стерилизованным воздухом, чтобы способствовать росту микроорганизма и таким образом повысить эффективность процесса превращения,Уад реакции микробного превращения контролируют взятием образцов бродильной среды при различных временных интервалах и зкстракцией при рН 8,0 смесью дихлорматан-метаал в отношении 9;1, Когда пробу органического экстракта падверга 1 пт то 11 каслс)Йи аЙ хроматографии, используя в 1(ачестве элюента смесь хлороформа, ме 1 анала, уксусной кислоты и воды в ат 11 ашении 80:20:7;3 по объему, соединение ГСЕ 24883появляется при значении Ю среды 0,5.,)агда как 4-дезакси-йа.:,адаксаруби .-,г 1циЯ находят при Г(Г 0,60, О)1 и 1 астьенае ОГ 1 ределение двух а 11 трс 11 иклиав 1 ла)кет быть осуществлено посл-:; тацкаслайнай хроматографии с упомянутой выше элюиру 1 ащей системой, саскабливднием и в 1:мывднием метанолам соответст 1)у 1 аи)их зан с красным окрашивднием и КО 11 счым спектрометрическим определением при 496 нанаметрах,Весь ферментациан 1 Ьй Сульа, - ; ка)О- рам саединеиеподвергается превращению в соединение ГСЕ 248831), фильтруют с помощью диатамавой земли, ОтфильтраванныЙ красный мицелиЙ экстра Гиауют смешивающимся с водой органическим растваритела 1 л, таким как метанол и другие низшие спирты, диаксан, ацетанитрил и предпачтител 1.а ацетон. Экстракты мицелия собира 1 ат, концентрируют при пониженном давлении и абьединяют с профильтрованной ферментацианной жидкостью, устанавливают рН 8,0, затем экстрагируют несмешива 1 ащимся с водой органическим растворителем, таким как н-бутанол, хлороформ, дихларметдн или предпочтительно смесь дихларметан-метанол в отношении 9:1, Органические экстракты содержат сое 1760986,от соединение ГСЕ 24883 (11) как отдельныйпик с временем задержки 19,3 минуты, соответствующим времени медленно движущейся составляющей синтетического5 13-дигидропроизводного,Метод жидкостной хроматографии высокого давления. Колонка: две секции ЯРсферисорб 5 30052 (С 18 Зр, разделение фазВеликобритания) размером 150 х 4.5 мм,соединенные в ряд; температура.45"С; мобильная фаза А: 0,05 М водного КН 2 РО 4,подкисленного до рН 3,0 смесью НзРО-метанол в отношении 80:2 по объему; подвижчая фаза В: метанол; проявление,иэократное за 30 минут (42;4 А+ 587 В): скорость потока 0,6 мл/мин; детектированг.е:254 нанометра,Кислотный гидролиэ соединения (1)(0,2 н. хлористоводородная кислота, 80 С,30 минут) дает красный осадок соответствующего агликона, тогда как сахарная компонента, а именно З-амино,3,4.б-тетрадеэокси-иод-.:ликсогексогексоза, присутствует в водной фазе и идентифицирована всравнении с аутентичным образцом, полученным при кислотном гидролиэе соединения (1).Цитотоксическую активность соединения ГСЕ 24883 испытывают 1 п ч 1 тго на клетках Не 1 аи Р 388 в сравнении с соединением,табл. 1),Активность 1 п что соединения ГСЕ24883испытывают против рассеянноголейкоза Гросса. Мышам линии СЗН вводятвнутривенно инъекцию 210 клеток намышь, збрэбатььают соединениями и иэу"аюг 24 часа весле опухолеВОЙ инъекции,0 Н Н МН г-гС 130г"ГСЕ 24883 (11) как свободное основаниерастворимо в полярных органических растворителях и водных спиртах, тогда как егогидрохлорид (111) растворим в воде, но мало растворим в органических растворителях. Гидрох.",орид соединения СЕ 24883имеет следующие физико-химические свойства:Точка плавления: 200 С (разлагается): 40удельное вращение а )о + 1880 (с ==0,05, метанол),Спектр поглощения в УФ и видимой области: Н 20 Ямакс 232, 254, 290 и 480 нанометров ( я= 492, 370, 127, 163);ИК-спектр (КВг); пики при следующихчастотах: 3400, 2970, 2920, 1610, 1580, 1472,1440, 1410, 1380, 1355, 1320, 1280, 1235,1210, 1110, 1080, 1060, 1030, 1010, 985, 965,940, 920; 900, 890, 870, 860, 830, 810, 785,755, 730, 710, 540, 480, 450 и 415 смСпектр ЯМР на ядрах 1 Н (ДМСО-бо, 200МГц, 22 С) млн,д: 14,03 (широкий синглет,2 Н, ОН-б, ОН), 7,6-7,0 (м, ЗН, Н, Н,Н-З), 5,26 (м, 11, Н), 4,96 (д, Л = 5,2 Гц, 1 Н,ОН),4,92 (м, 1 Н, 1-7), 4,55(м, 1 Н, Н),4,51(т,= 6,7 Гц, 1, ОН). 4,20 (с, 1 Н, ОН),3,97 (с, ЗН, 4-ОСНз), 3,76 (ддд, 3 = 3,5, 6,7,11,0 Гц, 1 Н, СН(11) ОН), 3.60 (д,кв.,= 1,0,динение ГСЕ 24883 (1 1) вместе с соединением (1) и небольшими количествами других продуктов разложения.Органический экстракт концентрируют при пониженном давлении досуха и остаток растворяют в дихлорметане и хроматографируют на колонке силикагеля, стабилизированного буфером с рН 7,0, градиентом смеси дихлорметан-метанол-вода, Соединениевымывают первым смесью в отношении 95;5:0,25, затем соединение ГСЕ 24883 (11) смесью в отношении 90:10:0,5, Из объединенных фракций после промывки водой, концентрирования до небольших объемов в присутствии н-пропанола, добавления эквивалента хлористоводородной кислоты и избытка н-гексана, получают п реципитат чистого ГСЕ 24883 (1) в виде гидрохлорида ( ) 6,0 Гц, Н), 3,48 (ддд, . = 7,2, 6,7. 11,0 Гц, 1 Н, СН(Н)-ОН): 3,37 (ддд,= 5,2, 3,5, 7,2 Гц, 1 Н, Н), 3.,02 (м, 1 Н, Н-З), 2,81 (м, 2 1 СН 2- 10), 2,15 (дд, 3 =- 2,0, 15,3 Гц, 1 Н, Н-йе), 1.97 (дд, Л = 6,0, 15,3 Гц, 1 Н, Накс), 1,7 - 1,9(м,2 Н, СН 2-2) и 1,14 (д.= 6,0 Гц). ЗН, СНз); молекулярная формула: С 27 Нзой 1 о НС. гп/7 в О эквиваленте к свободному основанию: 656 (МН); 655 (М) и 410 (М+), соответствующие агликону.Селективная жидкостная хроматография высокого давления позволяет разделигь (два максимума с временем задержки 18,8 и 10,3 минут) два стереоиэомерных спирта при С, присутствующих в образце синтетического 4-деэокси.-13-дигидроиододоксорубицигга, полученного восстановлением йода боргидридом натрия,Используя тот же метод жидкостной хроматографии высокого давления, получаПри оптимальной дозе соединение ГСЕ 24883 (11) более активное, чем доксорубицин, и такое же активное, как 4-дезокси- -йододоксорубицин (1), с малой токсичностью, проявленной при активных дозах. Противоопухолевую активность соединения ( 1), оцененную как среднее время выживания обработанных животных над контрольными мышами, можно сравнить с активностью соединения (1) и доксорубицина (табл, 2).Способ иллюстрируется следующими примерами.П р и м е р 1. Культуру микроорганизма Ятгер 1 огпусез рецсет 1 цз штамм М 87 Р.1. (О М 2444) выращивают 14 дней при 28 С на скошенном агаре следующей поддерживающей среды (Среда.А); глюкоза 3%, пивные дрожжи 1,2%; ИаС 1 0,10 , КНгРО 4 0,05%, СаСОз 0,1 ; М 9304 0,005%; ГеЯО 7 НгО 0,0005%: ЛпЯО 4 7 НгО 0,0005%; Сц 504 5 НгО 0,0005%; агар 2%, водопроводная вода до 100 мл, рН 0,7, Стерилизацию проводят нагреванием в автоклаве в течение 20 минут.Споры выращенной культуры собирают и суспендируют в 3 мл стерильной дистиллированной воды, Этой суспензией засевают 60 мл жидкой питательной среды, содержащейся в 300 мл колбах Эрленмейера: пивные дрожжи 0,30 , пептон 0,50 , Са(КОз) 4 НгО 0,05 о , водопроводная вода до 100 мл, Стерилизацию проводят нагреванием в автоклаве при 120 С в течение 20 минут, рН этой среды после стерилизации устанавливают между 6,8 и 7,0. Инокулированные колбы встряхивают два дня при температуре 28 С на роторной мешалке при 250 об/мин, описывающей окружность диаметром 7 см, 1,5 мл культуры, выращенной описанным способом, высевают в 300 мл колбы Эрленмейера, содержащие 50 мл следующей биотрансформирующей среды: дрожжевой экстракт 1,5 , КгРО 4 0,25 , глюкоза 1,50 , водопроводная вода до 100 мл, рН 6,9, Стерилизацию проводят нагреванием в автоклаве при 115 С в течение 20 минут, Раствор глюкозы стерилизуют отдельно и добавляют к каждой стерилизованной колбе в нужной концентрации.Затем содержимое колб инкубируют при 28 С в условиях, описанных для фазы посева, в течение 24 часов. В это время в каждую колбу добавляют по 1,0 мл раствора соединения (1) в стерилизованной воде в концентрации 5 мг/мл. Встряхиваемые колбы инкубируют еще два дня и получают 700 -ое превращение соединения (1) в соединение (11),П р и м е р 2. Культуру микроорганизма Я, рецсе 11 цэ штамм М 87 Е.1. выращивают5 10 на твердой питательной среде, как описано в примере 1. Споры трех скошенных агаров обьединяют и собирают в 10 мл стерильной дистиллированной воды. Полученную таким образом суспензию высевают в 2-х л опрокидывающиеся колбы с круглым дном, содержащие 500 мл посевной среды, описанной в примере 1. Колбу инкубируют 48 часов на.роторной мешалке, вращающейся со скоростью 120 об/мин и описывающей окружность диаметром 7 см, при температуре 28 С, Весь посевной материал инокулируют в 10 л бродильный чан из нержавеющей стали, содержащий 75 л биотрансформиру ющей среды, описанной в примере 1 и стерилизованной водяным паром при 120 С в течение 30 минут. Раствор глюкозы стерилизуют отдельно и добавляют в стерилизованный бродильный чан в соответствующей 20 концентрации, Культуру выращивают при28 С при помешивании с 230 об/мин и аэрации потоком воздуха со скоростью 1 л/л среды/мин. Через 48 часов доба вля ют субстратное соединение в концентрации, 25 описанной в примере 1, и после инкубирования культуры в течение 3-х дней получают 60%-ную конверсию соединения (1) в соединение ( 1).П р и м е р 3, Цельное сусло (5 л) из 30 ферментации, полученной по примеру 2,фильтруют с использованием 20/О диатомовой земли в качестве фильтра, Влажный осадок на фильтре экстрагируют ацетоном (3 л).После фильтрации проводят две дополни тельных экстракции ацетоном для достижения полного выделения красных пигментов.Обьединенные ацетоновые экстракты концентрируют при пониженном давлении и концентрат (1 л) объединяют с профильт рованным бульоном и исчерпывающеэкстрагируют при рН 8,0 смесью дихлорметан-метанол в отношении 9;1. Органический экстракт, содержащий соединения (1) и (1) с теми же продуктами распада, концентриру ют досуха при пониженном давлении. Остаток, растворенный в дихлорметане, хроматографируют на колонке силикагеля, стабилизированного буфером с рН 7,0. (М/15 фосфатный буфер), градиентом смеси 50 дихлорметан-метанол-вода. После вымывания некоторых продуктов распада элюируют соединение 1 смесью в оношении 95:5:0,25 с последующим элюированием соединения РСЕ 24883 (11) смесью в отноше нии 90:10;0,5.Из обьединенных фракций гасла промывки водой, концентрации до небольшого объема в присутствии н-пропанола, добавления одного эквивалента хлористоводородной кислоты и избыток н-гексана1760986 10 20 О ОН 0 ис ей,0 ч 1 го активность 13-/5/-дигидро-йододоксирубицина (со в сравнении с 4 -деэокси-йододоксирубицином (соединдоксорубицином (Дх) инение , ГСЕ 24 ие , ГСЕ 954)10,810,48 исла клеток в сравнении с контрольными необработаня 50 снижени эа, дающа,4вотнымиетки зпителиоидной ка88 - лейкозные клетки ыми жЬ) к с) Р иномы шеи человека получают чистое соединение РСЕ 248830,30, 60(-ный выход, в форме гидрохлорида (т.пл. 200 С, разлагается), Повторяя процесс, выделяют также нетрансформированное соединение(0.13 г, 26) в виде 5 гидрохлорида.П р и м е р 4. Образец соединения РСЕ 24883 (И) 200 мг растворяют в 0,2 н. водной хлористоводородной кислоте (50 мл) и нагревают 30 минут при 100 С. Кристалличе ский красный осадок (0,12 г) агликона собирают фильтрацией, промывают водой и сушат, Масс-спектр: е/е 416 (М ). Агликон идентифицирован как 13-(5)-дигидроадриамицинон сравнением с аугентичным образ цом,Формула изобретения1. Способ получения 4-деэокси(Я)- дигидро-йододоксорубицина формулы заключающийся в том, что штамм Ятгертотусз реосет ыз ОЯМ 2444 культивируют в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники азота и углерода и минеральные соли, в присутствии 4 -дезокси-йододоксирубицина в форме его хлоргидрата в конечной концентрации 0,1 мг/мл среды при температуре 27 - 30 С, полученную культуральную жидкость разделяют, отделенный мицелий экстрагируют ацетоном, а жидкую фазу смесьюдихлорметана и метанола в объемном соотношении 9;1 при рН 8,0, далее полученные экстракты объединяют и концентрируют при пониженном давлении до сухого состояния, затем концентрат растворяют в дихлормегане и хрсматографируют на колонке иэ силикагеля, забуференного до рН 7,0, злюируют последовательно смесью дихлорметана, метанола и воды при объемном соотношении 95:5:0,25 и 90;10:0,5 соответственно, полученный второй злюэт концентрируют в присутствии н-пропанола, выделяют целевой продукт и переводят в форму его хлоргидрата,2. Способ по п,1, о т л и ч а ю щ и я тем, что культивирование ведут 3 - 5 дн12 1760986 Таблица 2 Активность 13-/Я/-дигидройододоксирубицина (соединение 31, ЕСЕ 24883) в сравнении с 4 -деэокси-йододоксирубицином (соединение 1, ЕСЕ 21954) и доксорубицином (Дх) против рассеянного лейкоза Гроссаемя выживания обработанных мышей/среднее время выживанияивотных) х 100,результатам вскрытия погибших мышей. Составитель Г. СмирновТехред М.Моргентал едакт рректор О. Юрковецк аказ 3195 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 изводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина,а) Мышей линобрабатывалииньекции.Ь)(Среднее врконтрольных жс) оценено по и СЗН иньекцировали внутривенно 2 х 10 лейкозных клеток инутривенно соединениями через один день после опухолевой

Смотреть

Способ получения 4 -дезокси-13(s)-дигидро-4 йододоксорубицина