Способ исследования свертывания крови — SU 1777089 (original) (raw)
.Ы а 1 М 33/ 51) ГОСУДАР СТ ВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССР(71) Институт биохимии им, А.В. Палладина и Киевский медицинский институт им. А,А, Богомольца(72) Т,И. Лежен, Е.М, Макогоненко, Л,А. Колесник, С.А, Крамарев. Т,В. Мартынюк, С.И.Андрианов и С,А. Кудинов156) Баскова И,П. Практикум по физиологической химии, М, МГУ, 1976 г, с. 5-8.физиология человека, т,3 Кровь, кровообращение, дыхание под ред. Р, Шмидта и Г. Тевса, М. Мир, 1986 г. с. 25.Балуда В.П. и др. Лабораторные методь 1 исследования системы гемостаза, Томск, 1980.Слобожанкина И,Кфедорова З.Д., Использование стрептазы в методах лабораторной диагностики. Лабораторное дело, 1973, йт 9. с, 515.Молекулярная биология, 1986, т, 20, вып, 2, с. 461-470,Авторское свидетельство М 978862, кл. А 61 К 35/16, опубл. 1982 г.Ргос. Май Асад. Яс, ОБА, 1986, ч. 86, М 8, р. 2568-2571,Папаян А,В., Цыбулькин Э.К, Острые токсикозы в раннем детском возрасте, М. Медицина, 1984 г, с. 98,Кост Е,А. Справочник по клиническим и лабораторным методам исследования, М, Медицина, 1975 г. с. 57.Дранник Н.ГЕна Я.М., Варецкая Т.В, Продукты расщепления фибрина/фибриногена при патологических процессах. Киев, Здоровье - 1987 гс. 51 - 57.Бокарев И Н., Щепотин Б.М., Ена Я.М. Внутрисосудистое свертывание крови. Киев, Здоровье, 1989 гс. 77. с, 81,Изобретение относится к медицинской биохимии и может быть использовано в клинико-лабораторной практике в качест(54) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ(57) Использование: медицинская биохимия, клинико-лабораторная практика, тест для диагностики и лечения заболеваний, связанных с патологией системь 1 гемостаза, Целью изобретения является ускорение и упрощение способа. Сущность изобретения: в плазму, разбавленную вероналовым буфером в соотношении 1:10 - 80), вводят коагулянт тромбин в соотношении к стрептокиназе (1.25 - 2,5):(1 - 25) при рН 7,4, ионной силе 0,1 - 0,15, температуре 22 - 37 С и регистрируют спектрофотометрически изменения светорассеивания при 350 нм, определяя скорость и время свертывания плазмы, концентрацию фибриногена, ско- Я рость фибринолиза, время полулизиса и полного лизиса фибринового сгустка по полученному спектру, фиг. 2, табл, 3,ве теста для диагностизаболеваний, связанныхсистемы, 1777089Для объективного исследования заболеваний системы гемостаэа осуществляюттестирование несколькими способами, определяя основные параметры свертывания и фибринолиэа, например; скорость свертывания,содержание фибриногена в плазме и времялиэиса сгустка.Известны в клинико-лабораторнойпрактике следующие способы определения:- количественное определение содержания фибриногена в плазме крови путемвведения в нее смеси монойодуксусной кислоты с фосфатным буфером, инкубированияс тромбинсм, содержащим ионы кальция,растворение отмытого сгустка в 1,5 оь-нойуксусной кислоте в соотношении к плазме(20-25):1, общее время - около 40 - 50 мин,- определение времени лизиса сгусткав разведенной (1:10) крови без коагулянта втечение 7-8 ч,- определение времени лизиса эуглобулинового сгустка с добавлением во фракциютромбина и раствора хлористого кальцияпри температуре 37 С, общее время 3 - 4 ч внорме,- определение времени эуглобулинового лиэиса на фибриновых пластинах, общеевремя 18-24 ч,- определение времени лизиса эуглобулинового сгустка при введении во фракциюстрептокиназы,Из числа известных аналогов прототипом заявляемого способа является способопределения времени лиэиса эуглобулинового сгустка, который включает осуществление следующих операций:- получение зуглобулиновой фракциипутем введения 0,016уксусной кислоты вплазму, выдерживание в течение 20 мин, вхолодильнике, центрифугирование, отделение и высушивание осадка,- введение фосфатного буфера, тщательное перемешивание,- добавление смеси стрептокиназы(фирма Стрептаза, Швейцария и 0,27705раствора хлористого кальция при легком покачивании;- после образования сгустка следят спомощью секундомера за временем лизиса,норма которого составляет 10+0,5 мин.Общая продолжительность способа -40 - 60 мин,Однако все известные способы обладают существенными недостатками: они требуют значительного времени и определяюттолько один параметр сложной системы гемостаза, причем, в основном, визуальнополуколичественно,Целью изобретения является ускорениеи, упрощение способа.50 концентрации свертываемого фибриногенаплазмы, что позволяет определить его точную концентрацию по калибровочной кривой, приведенной на фиг,2. Скорость увеличения светорассеяния, определяемаяпо тангенсу угла наклонакасательной, проведенной к точке максимального увеличения светорассеяния (сц а на фиг.1), характеризует скорость образования фибрина в плазме (1), Такая характеристика об 101520253040 Цель достигается тем, что в способе определения параметров свертывания и фибринолиза крови, включающем последовательное введение коагулянта истрептокиназы во фракцию крови, перемешивание смеси определение параметров путем регистрации изменения светорассеяния, о качестве сырья используют плазму, разбавленную в вероналовом буфере в соотношении 1;(10-80), в которую вводят коагулянт тромбин в соотношении к стрептокиназе 1,25 - 2,5:(1 - 25) при рН 7,4, ионной силе 0,1 - 0,15 и температуре 22- 37 С и регистрируют спектрофотометрически изменения . светорассеяния при 350 нм, определяя скорость и время свертывания плазмы, концентра цию фибриногена, скорость фибринолиза время полулиэиса и полного лиэиса фибринового сгусткаБлагодаря указанному диапазону соотношений тромбина к стрептокиназе (1,25- 2,5):(1.-25), определенным показаниям, характеризующим кислотно-щелочное состояние. ионную силу температуру, достигается сначала свертывание фибриногена под действием тромбина, а затем лизис фибринового сгустка под действием стрептокинаэц во времени, достаточном дляодновременного спектрофотометрического определения шести параметров свертывания и фибринолиэа на одном образце плазмы,Общая продолжительностьспособа-неболее 10 мин в норме, что значительно меньше времени, которое затрачивают при осуществлении известн ых аналогов.На фиг.1 .представлена стандартная кривая изменения светорассеяния присвертывании илизисе фибрина в разбавленной плазме крови; на фиг,2 - калибровочная кривая для определения концентрации фибриногена в донорской плазме по максимальному светорассеянию.Левая часть кривой на фиг.1 характеризует процесс свертывания фибриногена, сопровождающийся увеличением поглощения вплоть, до максимального значения (Емвкс.- Ш), Эта величина прямо пропорциональнащепринята при изучении полимеризациифибрина.Время достижения максимального светорассеяния (11) представляет собой времясвертывания плазмы (11), После этого, каквесь фибриноген плазмы превратится вфибрин и формируется сгусток, начинаетсяего лизис под действием стрептокиназы, сопровождающийся уменьшением светорассеяния до исходного уровня. Скоростьуменьшения светорассеяния (с 9 Д характеризуетскорость фибринолиза(И), Время, закоторое максимальное светорассеяниеуменьшается в 2 раза (11 д) представляетсобой время полулизиса сгустка Я, а время,эа которое Езю возвращается к исходномунулевому уровню (т 2) - время полного лизиса - (И). Эти параметры (время полулизисаи время полного лиэиса сгустка) характеризуют фибринолитический потенциал плазмы и используютсядля оценкифибринолитической активности (7). Уменьшение времени полулизиса/лизиса сгусткасвидетельствует об ускорении, а увеличение - об угнетении фибринолиза, Определение оптимальных условий способа,заявленных в формуле изобретения, проводят экспериментально. При концентрациитромбина до 1,0 Й 1 Н ед/мл скорость свертывания растет, а затем остается постоянной. Скорость и время лизиса не зависят отконцентрации тромбина в диапазоне 0-5й 1 Н ед/мл.При увеличении концентрации стрептокиназы до 0 - 25 ед/мл параметры свертывания не изменяются. в то время как скоростьлизиса растет, а время лизиса уменьшаетсяв интервале концентрации стрептокиназы0-4 ед/мл, а затем зти параметры не меняются в пределах от 4 - 25 ед/мл,Оптимальными концентрациями тромбина и стрептокиназы для обеспечения высокой воспроизводимости истандартизации являются концентрациитромбина (1,25-2,5) й 1 Н ед/мл и стрептокинаэы 1-25 ед/мл,Степень разбавления плазмы вероналовым буфером лимитируется чувствительностью спектрофотометра (СФ).Влияние содержания фибриногена вплазме,на параметры свертывания и фибринолиза изучают следующим образом: к0,1 мл донорской плазмы с известным содержанием фибриногена добавляют возрастающие количества фибриногена илииспользуют различные разбавления плазмы. Тромбин (2,5 И 1 Н/мл) вводят при постоянном количестве стрептокиназы (1 или5 ед/мл). Как видно, на фиг.2 увеличениеконцентрации фибриногена сопровождается возрастанием величины Емакс(П, причемзависимость ее от концентрации фибриногена носит линейный характер, Увеличениеколичества вносимой в пробу плазмы в 25 раза также приводит к 2-кратному увеличению Емакс, поэтому для построения калибровочной кривой можно использоватьразличные разведения донорской плазмы.Полученная линейная корреляция Е, и10 концентрации фибриногена дает возможность быстро определять концентрациюфибриногена в плазме.Все исследования следует проводить вопределенном диапазоне температур 22 в .15 37 С. Понижение температуры снижает скорость свертывания и фибринолиэа,Для ускорения этих процессов при температуре 22 С следует увеличить количество стрептокиназы (пример 5). Повышение20 ионной силы выше 0,15 тормозит свертывание фибриногена плазмы, а при пониженииионной силы менее 0,1 увеличивается Емакс.светорассеяния.Способ проводят при строгом соблюде 25 нии физиологического значения рН - 7,4,т.к,при подкислении среды до рН 5,4 скоростьсвертывания (тц а) уменьшается в 3 раза,скорость. фибринолиза (т 9 3-Ч) - в 2 раза.При подщелачивании до рН 8,0 увеличива 30 ется активность плаэмина, что вызывает быструю деградацию фибриногена,П р и м е р 1. В термостатированнуюкювету спектрофотометра с автоматическойрегистрацией светорассеяния (Л 350 нм)35 вносят последовательно 0,1 мл беднойтромбоцитами цитратной плазмы крови человека (здорового донора), 1,84 мл 0,02 Мвероналового буфера, содержащего 0,13 МКаС и 0,001 М СаСг, т.е. соотношение плаз 40 мы к вероналовому буферу 1:20 (при рН 7,4ионной силе 0,15) 0,01 мл раствора стрептокиназы (1000 ед/мл) до конечной концентра,ции 5 ед/мл и 0,05 мл раствора тромбина(100 К 1 Н ед/мл) до конечной концентрации45 2,5 И 1 Н ед/мл втом же буфере, Смесь тщательно перемешивают, фотометрируют притемпературе 37 С и проводят анализ кривойизменения светорассеяния, полученной спомощью самописца (фиг. 1) для определе 50 ния времени свертывания (11, мин.), скорости свертывания фибриногена (19 а),(Емакс), по которой, находят концентрациюфибриногена в плазме(фиг.2), скорость фиб 55 ринолиэа (щф, время полулиэиса (таад, мин)и время полного лиэиса (тг, мин) фибринового сгустка. Результаты расчета приведены втабл.1,Примеры 2 - 5, 1777089Все операции, проводимые с донорскойплазмой, регистрацию светорассеяния и определение шести параметров свертыванияи фибринолиза осуществляот согласно описанию примера 1, 5Условия, режимы и результаты для каждого примера представлены в табл,1,Пример 6,Бсе операции, проводимые с плазмойкрови больного гастроэнтероколитом (ГЭ, 10регистрацию светорассеяния, а затем определение шести параметров свертывания ифибринолиза осуществляют согласно описанию примера 1,Условия, режимы и результаты представлены в табл,1,Пример 7.Бсе операции, проводимые с плазмойкрови больного ишемической болезнью сердца (ИБС) перед операцией (артериокоронарное шунтирование), регистрациюсветорассеяния и определение шести параметров свертывания и фибринолиза осуществляют согласно описанию примера 1.Условия, режимы и результаты представлены в табл,1,Доказательство точности нового способа проводят по двум схемам сравнения,1, Сопоставляют результаты определения параметров свертывания и фибринолиза на плазме 10 здоровых доноров припостоянной т 37 С, ионной силе 0,15 рН 7,4разбавлении плазмы о вероналовом буфере1,20, концентрации тромбина 2,5 И 1 Нед/мл, стрептокиназы 5 ед(мл. 35Результаты, представленные в табл,2,показывают тождественность параметров,, Сопоставляют результаты определеиля концентрации фибриногена по новомуспособу и способу-аналогу. Новый метод позволяет получить те же самые результаты впределах ошибки сравниваемых методов,Способ по точности не ус упает известным аналогам.Полученные результаты по способу полностью совпадают с результатами общепринятых коагулологических методов оценкисостояния гемостаэа, в частности, определение времени свертывания количестватромбоцитов, содержания продуктов расщепления фибриногена (фибрина-ПРФ) ирастворимых комплексов фибрина - РКФ антитромбина, протромбинового индекса.Греимущества нового способа в сравнении с известными аналогами заключаются в следующем:- сокращение времени до 10 мин в отличие от известных способов: 40-60 мин или 3 - 24 ч,- многоаспектность диагностических исследований за счет расширения диапазона определяемых параметров: вместо одного параметра одновременно определяют 6 параметров свертывания и фибринолиза- упрощение методологических приемов за счет исключения сложного получения эуглобулиновой фракции;- условия и схема проведения нового способа позволяют осуществить компьютеризацию процесса диагностических исследований плазмы крови.Формула изобретенияСпособ исследования свертывания крови, включающий определение показателей свертывающей и фибринолитической систем крови, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, в кювету спектрофотометра вводят бедную тромбоцитами плазму и вероналовьй буфер в соотношении ИЧ 1:10-80 при ионной силе 0,1-0,15 рН - 7,4, затем добавляют растворы стрептокиназы и тромбина в соотношении (1,25 - 2,5):(1 - 15) и регистрируют кинетику светорассеяния при 350 нм, а показатели систем крови рассчитывают из характеристик полученной кривой соответствующих калибровочных кривых, при этом о содержании фибриногена судят по максимальному светорассеянию, о скорости свертывания фибриногена - по тангенсу угла, образуемого касательной к точке максимального увеличения светорассеяния, о времени свертывания фибриногена - по времени достижения максимального светорассеяния, о скорости фибринолиза - по тангенсу угла наклона касательной к точке максимального уменьшения светорассеяния, а о времени полулизиса и полного лизиса - соответственно по времени уменьшения максимального светорассеяния в два раза и по времени возвращения светорассеяния к исходному уровню.1З 1 1- ИхэкстрГхэ хх ах 3060 ССЫ О,О 1-Э Ю12 1777089 Таблица 2 Таблица 3 Определение концентрации фибриногена в плазме крови челове- ка 2 4,. 6Концентрация ФибриногеФиг. 2Составитель А, АгуреевсТехред М.Моргентал л плаз КоРРектор Н. Ревская к аказ 4120 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при113035, Москва, Ж, Рэушская наб., 4/5 бййат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 10 Производственно-издательск