Способ очистки протеолитических ферментов — SU 942427 (original) (raw)
СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ ЯОРЕСПУБЛИН Н 9) (И) А 1(51) С 12 5 ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН.К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ о тличаю в качестве кон используют п=бе 3, Способ по п,щ и й с я тем, чтоденсирующего агент и юи икуемое(54) (5ЧЕСКИХческойраств цес 7 9, ем, что ведут десорбов мно- пентаэсорбцию в прису цию - в гоатомны ритрита ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТ(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмови Московский ордена Ленина, орденаТрудового Красного Знамени и орденаОктябрьской Революции государственный университет им. М.В. Ломоносова(56) 1. Авторское свидетельство СССРго заявке Р 2370306/04,кл. С 07 С 7/02, 1976, непубл(прототип). 7) 1,СПОСОБ ОЧИСТКИ ПРОТЕОЛИТИФЕРМЕНТОВ путем биоспецифисорбции ферментсодержащихоров при рН, большем или равном 1,8, на нерастворимом носителе, который предварительно вводят во взаимодействие с раствором конденсирующе" го агента и лигандом, с последующей десорбцией сорбированных ферментов солевыми буферами или солевыми растворами органических растворителей, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения эффективности процесса эа счет увеличения выхода ферментов высокой степени чистоты и активности, а также удешевления и упрощения процесса, в качестве носителя используют аминопроизводное кремнеземсодержащего материала, а процесс ведут при рН 1,8-9,5 в зависимости от рН-оптимума фермента,2. Способ по и, 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве носителя используют аминосилохром.(зохинон, или карбодиимид, ил гексаметилендиизоцианат.4. Способ по г 1, о т л и ч а щ и й с я тем, что в качестве лиганда используют п-(И-аминометил) производное фенилборной кислоты ил антибиоэик-полипептид.5Способ по п. 4, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, в качестве антибиотика используют бацитрацин, или бациллихин, или грамицидин С.6, Способ по пп. 1-5, о т л ич а ю щ и й с я тем, что при очистке карбоксильных протеиназ в качест- р ве лиганда используют антибиотикполипептид, а процесс ведут при рН 1,8-5,0.7. Способ по пп. 1-5, о т л ич а ю щ и й с я тем, что при очистке сериновых протеиназ в качестве лиганда используют антибиотик - поли пептид, а процесс ведут при рН 6,0- 8,5. 8, Способ по пп. 1-4, о т л ич а ю щ и й с я тем, что при,очистке сериновых протеинаэ в качестве лиганда используют п-)-аминометил) Фенилборную кислоту, а процесс ведут при рН 6,0-9,5.9, Способ по п, 8, о т л и ч а ющ и й с я тем, что про с осуществляют при рН 7-8.10. Способ по пп1-4 и о т л и ч а ю щ и й с я тсериновых протеиназ тствии глицерина, а присутствии раствор х спиртов, напримерйа основе сефарозы, содержат от 0,8 до 8 мкмоль лиганда на 1 мл влажного сорбента. Такая концентрация лиганда не позволяет добиться максимальной сорбции фермента на единицу объема колонки. Для обеспечения более эффективного процесса очистки в ряде случаев полезно увеличить концентрацию лиганда, что позволяет увеличить выход ферментов по активности и чистоте.Целью изобретения является повышение эФфективности процесса за счет Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к области получения нысокоочищенных и высокоактивных ферментныхпрепаратов, которые могут быть использованы в медицине, биохимии ипищевой промышленности, в производстве моющих средств, а также для исследовательских целей,Наиболее перспективным для избирательной очистки Ферментов является метод аффинной хроматографии, основанный на сродстве Ферментов кспецифическим аналогам субстрата илиингиЬиторам, коналентно связанным снерастворимым носителем, что позволяет разделять ферменты на основеих биологической специфичности, апотому достигать более высокой степени очистки по сравнению с другиминидами хроматографической техники,Наиболее широко выделение Ферментов биоспецифической хроматографией ведут с помощью биоспецифических сорбентов, представляющих собойнерастворимые носители - производные агарозы, активированные бромцианом и ковалентно связанные с лигандами - веществами специфическимидля данного класса Ферментов,Известен способ очистки протеолитических Ферментов путем Ьиоспецифической сорбции ферментных растворонна нерастворимом носителе представляющем собой производное агарозысефарозу 4 В, который коналентно связан с лигандом посредством конденсирующего агента (бромциана) с последующей десорбцией сорбированныхферментов, причем в качестве лигандаиспользуют антибиотик-полипептидбацитрацин, являющийся неконкурентнымингибитором ряда протеиназ.Очистку проводят при рН 1,8-8,0.Десорбцию осуществляют солевымибуферами или буферами с добавлением1органических растворителей 1 .Выход Ферментов по активностидостигает 86, степень очистки 295 раз в зависимости от чистоты исходного препарата,Данный способ обладает рядом ненестаткон.Применяемая сефароза 4 Б являетсяимпортным дорогостоящим продуктом,Кроме того, недостаточная механическая прочность производных агарозы испособность их разрушаться под воздействием некоторых Ферментов, сопут"ствующих очищаемым протеиназам, ограничивает воэможности применения сеФарозы. Недостатком данного способаявляется также применение высокотоксичного бромциана. увеличения ныхода ферментов высокой степени чистоты и активности, а также удешевление и упрощение процесса.Указанная цель достигается предлагаемым способом очистки протеолитических ферментов путем сорбцииферментсодержащих растворов при рН,большем или равном 1,8, на нерастворимом носителе, который предваритель 20 но вводят во взаимодействие с раствором конденсирующего агента и лигандом, и десорбции , сорбированных 25 ферментов солевыми ьуферами или солевыми растворами органических растворителей, причем в качестве носителя используют аминопроизнодное кремнеэемсодеряащего материала, а процесс ведут при рН 1,8-9,5 в зависимости от рН-оптимума фермента.Кроме того, в качестве носителя используют аминопроиэводный кремнеэемсодержащий материал. Процесс ведут при рН 1,8-9,5. В качестве носителя предпочтительно используют аминопроизнодные макропористого микро- сферического кремнезема типа Поросил или Силохром (обычно - аминосилохром),Силохромы выпускаются в больших количествах отечественной промышленностью и являются значительно более дешевым продуктом чем сефароэа,Используемый в способе аминосилохром характеризуется высоким. ссдержанием реакционноспособных аминогрупп, что дает возможность повыситьсодержание лигандов от б до 100 мк 60.моль на 1 мл влажного сорбента, а также обладает лучшими по сравнениюс сефарозой гидродинамическими свойствами, что позволяет увеличить скорость и производительность процесса Указанный способ не обеспечиваетдостаточной эффективности процессаочистки, так как сорбенты полученны очистки. имеющие внутри зерен крупные поры 40 более или менее однородного размера.Они отличаются высокой механическойи термической стабильностью. Крометого, важным преимуществом макропористых кремнеземов по сраннению с 45 другими материалами того же назначения, например сефарозой, являетсявысокая химическая чистота, строгоконтролируемый размер пор, возможность достижения больших скоростей 50 фильтрации и легкость стерилизации.10 Для десорбции используют растворы солей различной концентрации. В 60 тех случаях, когда фермент связывается с сорбентом настолько прочно, что его не удается элюировать, применяют растворы солей, к последним добавляют органические растворители, 65 декстраназ и Ферментов, способных гидролизовать агарозу. Неорганические носители на основе макропористого кремнезема устойчивы к действию Ферментов и бактерий. Описываемый способ поэволяет исключить примене ние высокотоксичного бромциана, заменить дорогостоящий импортный продукт сефарозу отечественными носителями, повысить эффективность процесса очистки.Описываемый способ позволяет очи. - щать с выходом 75-100 различные протеолитические ферменты с увеличением активности в 1,5-100 раз в зависимости от чистоты исходного препарата.Способ особенно эффективен при извлечении Ферментов непосредственно из культуральной жидкости, содержащей окрашенные примеси. В таких случаях выделяются практически чистые Ферменты, причем вследствие высокой избирательности сорбентов значительный эффект достигается в одностадийном процессе очистки.25Кроме того, описываемые биоспециФические сорбенты могут быть применены для работы с растворами в широком диапазоне рН (1,8-9,5), Это дает возможность использовать их для выделения протеолитических ферментов различных классоь, включая карбоксильные, сериновые, тиоловые, металлопротеиназы и экзопептидазы.Способ осуществляют следующим образом, 35Для синтеза носителей, необходимых для очистки требуемого Фермента, используют производные макропористых кремнеземов например аминосилохром который обрабатывают смесью конден О сирующих агентов и лигандов в соответствующих буферных системах. Например, для очистки карбоксильных протеиназ - смесью, содержащей бензохинон и антибиотики-полипептиды, для сериновых протеиназ - смесью,содержащей янтарный ангидрид, и-(й-аминометил)фенилборную кислоту и водорастворимый карбодйимид.Сорбцию Ферментов проводят в динамическом или статическом режиме, При этом происходит избирательное связывание протеиназ с нерастворимым носителем. Затем носитель со связанным белком промывают соответствующим буФерным раствором. При этбм происходит отделение примесей, в том числе и окрашенных. способствующие более эффективной десорбции,Очищенный фермент используют ввиде раствора или высушивают лиоФильно после обессоливания гельфильтрацией или диализа.В приведенных примерах по очисткеряда протеиназ на колонке с биоспецифическими сорбентами количество нанесенного и элюированного белка измерено в мг, а также в условных оптических единицах, т.е. в единицах оптической плотности при 280 нм,Активность ферментов измерена поскорости гидролиза гемоглобина (пример 1, 2); по,скорости створаживаниямолока (примеры 3 - 6), по скоростирасщепления синтетических субстратов: с -карЬоксипропионилфенилаланина (пример 7) и п-нитроанилида карбобензокси-( -аланил-(,-аланил.;лейцина (пример 8),П р и м е р 1, Очистка промышленного препарата пепсина свиньи набацитрацин-силохроме,Для синтеза бацитрацин-силохромаиспользуют 1 г аминосилохрома(340 мкмоль аминогрупп на 1 г) вО М Г 4 аНСОЗ , рН 10,0, 34 мг п-бензохинона в 2 мл абсолютного диметилформамида и 220 мг бацитрацина.Смесь осторожно перемешивают 4 ч иоставляют на ночь при 5 С, Затемсорбент тщательно промывают 0,1 МКаНСО- с рН 10, водой, спиртом, а7перед опытом всеми элюирующими растворами. Полученный темноокрашенныйсорбент по данным аминокислотногоанализа содержит 46 мкмоль бацитрацина на 1 г сухого сорбента, Дляочистки пенсина 0,1 М ацетатный буФерный раствор с рН 5,0, содержащийнеочищенную протеиназу с удельнойактивностью 23 е,а,/о,е пропускаютчерез хроматографическую колонку(5 х 0,5 см), заполненную Ьацитрацинсилохромом. Затем сорбент промываютисходным буфером. Активный Ферментэлюируют 25%-ным изопропиловым спиртом в 1 М ИаС с рН 5,0. Удельнаяактивность пепсина свиньи в элюате34 е.а./мг. Выход по активности 100%,очистка в 1,5 раза.П р и м е р 2. Очистка промышленного препарата пепсина свиньи набациллихин- силохроме,Промышленный препарат бациллихина содержит нерастворимый наполнитель. Для извлечения Ьациллихина препарат трижды экстрагируют кипящимметанолом или этанолом, Экстрактыупаривают в вакууме до небольшогообъема, Осадок бациллихина, выпавшийпри охлаждении, отфильтровывают ивысушивают,Для .синтеза бациллихин-силохромаиспользуют 100 г аминосилохрома(120 мкмоль аминогрупп на 1 г) в 0,1 М ИаНС 03, рН 10, 864 мг и"бензохинона в 50 мл абсолютного диметилФормамида и 12,8 г бациллихина. Смесь осторожно перемешивают 4 ч и оставляют на ночь при 5 ОС. Затем сорбент тщательно промывают 0,1 М БаНСО, рН 10, водой, спиртом, а перед опытом всеми элюирующими растворами. Полученный темноокрашенный сербент по данным аминокислотного анализа содержит 16 мкмоль бациллихина на 1 г сухого сорбента, Для очистки пепсина 0,1 М ацетатный Ьуферной раствор м рН 5,0, содержащий неочищенную протеиназу с удельной активностью 22 е.а,/о.е., пропускают через хроматографическую колонку (5 х 0,5 см), заполненную бациллихинсилохромом, Затем сорбент промывают исходным буфером. Активный фермент элюируют 25 Ъ-ным изопропиловым спиртом в 1 М ИаС 8, рН 5,0. Удельная активность пепсина свиньи в элюате 34 е.а./мг, Выход по активности составляет 100, очистка в 1,5 раза,П р и м е р 3. Очистка протеиназы из Тг 1 С)2 обег 2 па Ы 19 погц 2 п на бацитрацин-силохроме.Синтез Ьацитрацин-силохрома осуществляют по примеру 1. 0,1 М ацетатный буферный раствор с рН 5,0, содержащий 4 г. ьелка (неочищенную смесь протеиназ и целлюлаз) с удельной активностью 13,0 е.а,/о.е пропускают через хроматографическую колонку (бх 1,5 см), заполненную бацитрацин-силохромом, Затем сорбент промывают исходным буфером и элюируют послЕдовательно 1 М БаС( в том же буфере и 25-ным изопропанолом в 1 М ИаС, рН 5,0. Собирают солевую (1) и изопропанольную (11) Фракции элюата, содержащие активный белок, Удельная активность Фракции 1 216 е.а./о.е. Очистка в 16,6 раза. Удельная активность Фракции 11 58,6 е.а./о.е. Очистка в 4,4 раза. Выход активного белка 97.П р и м е р 4. Очистка ультрафильтрата культуральнай жидкости базидального гриба Нцяяц 1 а с 1 есйагапя Гг в 04 на бацитрацин-силахроме,Синтез бацитрацин-силохрома осуществляют по примеру 1. Ультрафильтрат культуральной жидкости с удельной активностью 13 е,а,/о,е, по створаживанию молока пропускают через хроматаграфическую колонку (бх 1,5 см), заполненную бацитрацинсилохрамом и уравновешенную 0,1 М ацетатным ьуфером, рН 4,5. Затем сорбент промывают исходным буфером и последовательно элюируют 1 М БаС 1, рН 4,5 в том же буфере (фракция 1) и 25-ным изопропанолом в 1 М ИаС 1 рН 5,0 (Фракция 11), Удельная активность фракции 1 - 664 е.а./о.е очистка в 51 раз, фракции 1)260 е.а./о.е., очистка в 20 раз.Выход активного белка 100.П р и м е р 5. Очистка ультраФильтрата культуральной жидкости базидального гриба Вцяяц 1 а бесйогапяГгна бациллихин-силахроме,Синтез бациллихин-силохром-. осуществляют по примеру 2, Ультрафильтрат культуральной жидкости, с удельной активностью 3,3 е,а./о.е. пропускают через храматографическую колонку (5 х 0,5 см), заполненную бациллихин-силохрамом, уравновешенную0,1 М ацетатным буфером, рН 4,5. За 15 тем промывают сорбент тем же буфером. Активный фермент элюируют 20 Ъизопрапанолам в 1 М ИаС 1, рН 4 5.Удельная активность Фермента в элюате 120 е,а./а.е., очистка в 36 раз.2) Выход пО активности 90 вН р и м е р 6. Выделение двухпротеиназ из высушенного экстрактакультуральной жидкости базидальнагогриба Нцяяц 1 а с 1 есс(огапя Ггспомощью бациллихин-силохрома и грамицидин-С-силохромаЭкстракт, содержащий фсрмент судельной активностью 180 е.а./о.е.,пропускают через храматаграфическуюколонку (25 х 125 см) с бациллихинсилохромом, уравновешенную 0,1 Мацетатным буфером, рН 4,5. Собираютпрошедший через сорбент раствор,который содержит протеиназу 1. Удельная активность раствора 2,6 е.а./о.еКолонку промывают исходным буфером.Протеиназу 11, сорбированную на колонке элюируют 20 нь 1 М изапропаналомв 1 М ЙаС 1, рН 4,5. Удельная активность фермента в элюате 380 е.а./о.е.40 Выход па активности 88 Ъ, Очистка в2,4 раза,Раствор, содержащий пратеиназу 1,не сарЬировавшуюся на бациллихинсилахромер пропускают через хроматаграфическую кОлОнку (18 х 1 см) сграмицидин-С-силахромам,Для получения сорбента используют50 г аминосилохрома (50 мкмоль аминогрупп на 1 г) в 0,1 М ИаНСО 1, рН 10,162 мг и-ьензохинона в 30 мл абсалютнага диметилформамида и 2,.1 гграмицидина Сусловия синтеза тежег чтО В приысрах 1 р 2,Колонку с сарбираваннай протеиназой 1 промывают 0,1 М ацетатным буФером, рН 4,5, актив 11 ый Фер 21 ентэлюируют 20-ным изопрапанолам в1 М 1 чаСВ, рН 4,5. Удельная активностьфермента в злюате 370 е,а./а,е.,-очистка в 3,7 раза, выход па актив 60 ности 60,П р и м е р 7, Очистками;-химатрипсина на Фенилборонат-силохроме,Для синтеза сорбента испольэовали аминосилахром (415 мкмоль амино 942427 10групп на 1 г), янтарный ангидрид ихлоргидрат п-(Я-аминометил)фенилборной кислоты,3 г аминосилохрома обрабатываютв течение 20 мин при 20 С растнойром 1 г янтарного ангидрида в 9 мл 5диметилформамида. Избыток ангидридаудаляют промывкой 50 мл диметилформамида и водой, К 3 г полученногосукцинилсилохрома прибавляют 333 мгхлоргидрата и-(И-аминометил)фенилборной кислоты в 15 мл воды. Затемпри рН 5 добавляют 3 г водорастноримого карбодиимида. Смесь выдерживают 1 ч при 20 С при осторожном периодическом перемешивании. Сорбентотфильтровывают и промывают большимколичеством воды, а перед опытомвсеми элюирующими растворами, Полученный Фенилборонат-силохром содержит 215 мкмолей лиганда на 1 г сухого сорбента (или 100 мкмолей на1 мл влажного сорбента), На колонкус 2 мл фенилборонат-силохрома наносят раствор 10 мг М -химотрипсинав 10 мл 0,05 М фосфатного буфера,рН 7,5. Удельная активность раствора0,025 е,а,/мг. Затем сорбент промывают 50 мл исходного буферал 1 М ИаС 1в том же буфере, 0,5 М глицериномв том же буфере, Фосфатным буфером,рН 9, и элюируют белок 0,5 М пентаэритритом в 0,05 М фосфатном буфере,рН 9. Получают 5,9 мг белка с удельной активностью 0,053 е,а./мг. Выход по активности 100, очистка н1,7 раза. 35П р и м е р 8. Очистка субтилизина Ана фенилборонат-силохроме.На колонку с 4 мл фенилборонатсилохрома, полученного по методу, 4 Оприведенному н примере 7 и уравновешенного 0,05 М фосфатным буфером,рН 7,5, наносят 40 мл культуральнойжидкости Вас. БыЬ 111 з Ас рН 7,5,с удельной активностью 0,08 е,а,/мгпо гидролизу Е-А 1 а-А 1 а-Ьец-рКА, Колонку последонательно промывают0,05 М Фосфатным буфером, рН 7,5,1 М БаС 1 в том же буфере, 0,5 М глицерином н том же буфере, 0,05 М фосфатиым буфером, рН 9. Активный белокэлюируют 0,5 М пентаэритритом в0,05 М Фосфатном буфере, рН 9. Послеобессоливания и лиофилизации получают 2,26 мг белка с удельной актинностью 1,08 е.а./мг, выход 80, 55очистка в 13,7 раз,П р и м е р 9Синтез Фенилборонат-силохрома с применением в качестве конденсирующего агента гексаметилендиизоцианата, 60К 1 г аминосилохрома (340 мкмольБН-групп) приливают избыток гексаметилендиизоцианата и оставляют прикомнатной температуре на 15 мин, затем промывают аминосилохромдиметилФормамидом и водой, Получают сорбент,содержащий 300 мкмоль изоцианатныхгрупп на 1 г носителя, К 1 г такогосорбента приливают раствор 200 мги-(Я-аминометил)фенилборной кислотын 5 мл диметилформамида, оставляютна 20 мин при комнатной температуре,затем избыток реактивов отмывают диметилфррмамидом и водой. ПолучаютФенилборонат-силохром с содержаниемлиганда 150 мкмоль/г.П р и м е р 10. Очистка пепсинана грамицидин-С-силохроме,К раствору 25 мг препарата свиного пепсина (производства Московскогомясокомбината) в 10 мл 0,05 М универсального буфера, рН 1,8, добавляют200 мг грамицидин-С-силохрома, перемешивают 20 мин, раствор декантируют,промывают сорбент пять раз по 5 млуниверсального буфера, рН 1,8, и элюируют пепсин дважды по 5 мл 1 М хлористого натрия в 0,05 Я универсальномбуфере, рН 1,8, содержащем 25 изопропанола. Выход по активности 30,очистка в 10 раз,П р и м е р 11, Очистка субтилизина ВРИ на бацитрацин-силохроме.К раствору 25 мг субтилизина ВРИ(Серва) н 10 мл универсальногобуфера, рН 6,0, прибавляют 200 мгбацитра 7 ин-силохрома, перемешивают20 мин, промывают сорбент пять разпо 5 мл 0,05 М универсального буфера,рН 6,0, и элюируют субтилизин дваждыпо 5 мл 1 М хлористого натрия в0,05 М универсальном буФере, рН 6,0,содержащем 25 изопропанола, С выходом 45 получают субтилизин ВРИ,обладающий активностью по Е-А 1 а-А 1 а,еп в Р, 1,5 е.а./мг, очистка н1,5 раза.П р и м е р 12. Очистка субтилизина 72 на бацитрацин-силохроме. На колонку с 10 мл бацитрацин-силохрома, уравновешенную 50 М трис-буфером, рН 8,5, наносят раствор 2 г промышленного препарата субтилизина 72 (Протосубтилин ГЗх) с удельной активностью 0,166 е.а./мг. Колонку промывают 50 мМ трис-буфером, рН 8,5, затем 1 М хлористым натрием в том же буфере. Активный фермент элюируют 1 М хлористым натрием н 50 мМ трисбуфере, рН 8,5, содержащем 20 изопропанола. В результате получают 56 мг препарата с удельной актинностью 7,7 е.а./мг, Выход по активности 130, очистка в 40 раз. П р и м е р 13, Очистка щелочной сериновой протеазы Вас. Ь 1 спеп 1 йоги 1 з на фенилборонат-силохромеНа колонку с 4 мл Фенилборонатсилохрома (200 мкмоль лиганда на 1 г сорбента), уравновешенную 0,5 М глицерином в 0,05 М фосфатном буфере,942427 СоставительРедактор О. Филиппова Техред А,Бабинец КорректорА, Зимокосов Эаказ 1009/1 Тираж 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Филиал ППП Патент, г, Ужгород, ул, Проектная, 4 рН 6,0, наносят раствор 10 мг промышленного препарата сериновой протеазы Вас. 11 спеп 1 йопп 1 з в 5 мл тогоже буфера. Колонку промывают тем жебуфером, 1 М хлористым натрием в0,05 М фосфатном буфере, рН 6,0, и0,05 М фосфатным буфером, рН 9,5. Протеазу элюируют 0,5 М пентаэритритом в 0,05 М фосфатном буфере, рН 9.5.Выход по активности 150, очистка в 5,6 раз, полученный препарат имеет удельную активность, определяемую пэ 5 гидролизу Е-А 1 а-А 1 а-Ьеч-рНА,18 е.а./мг.