Способ получения иммобилизованной глюкозоизомеразы — SU 1028251 (original) (raw)
ГОСУДАРСТВЕНПО ДЕЛАМ ИЗ БРЕТЕНИЯ ПАТЕНТУ 121) 2650551/28-13122) 22. 08. 78(54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАЕ 1 НОЙ ГЛ 0 КОЗОИЗОИЕРАЗЫ, включающий обработу клеточного концентрата - культуральной жидкости Вас 11 ця соа 9 цаль,.предварительно сконцентрированйой до содержания сухого вещества 3-30 вес.В: и подвергнутой гомогенизации до раэруюе- ф ОПИСАНИЕ И(51) С 12 й 9 92 С 12 И 11 0 ния 25-100 содержащихся в ней клеок раствором глутарового альдегида в количестве 0,01-1 вес.ч. на 1 вес.ч. сухого вещества в клеточно концентрате, выдерживание полученной смеси до образования геля и уда ление из геля избыточной влаги, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью активирования и стабилизации фермента, в полученный продукт вводят 0,1-0,5 вес.Ъ водорастворимой соли железа в твердом виде и 1 вес.Ъ окиси магния в расчете на сухое вещество обезвоженного геля с последующей экструзией и сущкой экструдата в псевдоожиженном слое,2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качеств соли железа используют сульфат железа (П 1) или аммонийцитрат железа(11 Ц, или цитрат железа (И 1), или пирофосфат железа (111), или сульфат железа (11), или лактат железа ИХ).40 Изобретение относится к способамполучения иммобилизованной глюкозоиэомеразы и может найти применение для получения активных и достаточно стабильных препаратов глюкозоизомераэы, используемой для конверсии глюкозы во фруктозу.Известен ряд способов полученияиммобилизованной глюкозоизомеразы,связанной с носителями как неорганической природы, так и органической( ионообменные синтетические смолыи производные целлюлозы).Однако для известных способовхарактерна недостаточная стабиль.ность получаемых продуктов, а также 15необходимость добавления ионов кобальта и магния во фруктозный сиропперед конверсией для активированияфермента и последующая ионообменнаяочистка целевого продукта. гоИзвестен также способ полученияиммобилиэованной глюкозоизомеразыпутем связывания фермента с диэтиламиноэтилцеллюлозой 1 .Наиболее близким к предлагаемомупо технической сущности являетсяспособ получения иммобилизованнойглюкозоиэомеразы, включающий обработку клеточного концентрата - культуральной жидкости Вас 11 нь соацц 1 апэ,предварительно сконцентрированнойдо содержания сухого вецества3-30 вес, и подвергнутой гомогенизации до разрушения 25-100 содержащихся в ней клеток растворомглутарового альдегида в колйчестве0,01-1 вес.ч. на 1 вес.ч. сухоговещества в клеточном концентрате,выдерживание полученной смеси дообразования геля и удаление из геляизбыточной влаги с последующейзаморозкой и измельчением продукта 2,Недостатком известного способаявляется невысокая активность и падение ее в процессе эксплуатации 45ферментного препарата.Целью изобретения является повышение стабильности и активизацийиммобилизованной глюкозоизомеразы.Укаэанная цель достигается способом получения иммобилизованнойглюкозоизомеразы, заключающимсяв обработке клеточного концентрата -культуральной жидкости Вас 111 цзсоадц 1 апь, предварительно сконцентри.рованной до содержания сухого вещества 3-30 вес. и подвергнутой гомогеиизации до разрушения 25-100содержащихся вней клеток раствором:глутарового альдегида в количестве0,01-1 вес,ч, на 1 вес,ч. сухого 60вещества в клеточном концентрате,выдерживании полученной смеси дообразования геля, удалении из геляизбыточной влаги, причем вполученныйобеэвоженный гель вводят 0,1-0,5 вес.65 водорастворимой соли железа в твердом виде и 1 вес, окиси, магнияв расчете на сухое вещество обезвоженного геля с последующей экструзией и сушкой экструдата в псевдоожиженном слое.В качестве соли железа используютсульфат железа 1111) или аммонийцитрат железа 111), или цитрат железа 111), или пирофосфат железа111), или сульфат железа 1 Т),или лактат железа (1).Для активизации и стабилизациииммобилизованной глюкоэоизомераэыв процессах конверсии глюкозы нецелесообразно соль железа вводить вглюкозный сироп, что требует дополнительного контроля за работой дозаторов, поскольку способностю энзима связывать железо либо незначительна, либо очень ограничена,точка насыщения достигается в течение длительного периода процессаизомеризации, В любом случае утечкажелеза в продуктовый поток можетпроисходить в любой точке процесса.Присутствие железа в продукте вызывает окраску в такой степени, чтотребуется,его очистка, например,ионообменом, что удорожает стоимостьочистки.Преараты клеточной массы изомеразы глюкозы могут связывать значительные количества железа, причемсравнительно небольшое количествожелеза теряется при длительном контакте с.глюкоэой и глюкозофруктозным сиропом. Количество железа,вводимого в препараты клеточноймассы, соответствует необходимомудля активации и стабилизации фермен.та количеству. ( Термин "клеточнаямасса", "препарат клеточной массы"и "порошок клеточной массы" применяются для определения формы,препарата и частиц, получаемых, формуемых или изготовленных иэ вещества клеток микроорганизмов вместес органическими реагентами, например глутарельдегидом, протеиновымии агломеризующими агентами, например полиэлектролитами).Кроме того, улучшение производительности и/или стойкости глюкозоизомеразы может происходитьесли другие твердые ингредиентытакже подмешиваются к энзимномупрепарату, Начальное падение рН,происходящее в течение 1-2 днпосле загрузки колонки свежим препаратом, вызывает ряд трудностей.Уменьшение рН в колонке нежелательно, поскольку оно вызывает сокращение активного энзимного слоя, т,е.падение активности,Введение 1 по весу окиси магнияна сухое вещество изомеразы глюкозымоногидрата декстроэы. После переме- .шивания гранулят экструдируют и сушаткак в партии Л. Содержание ИдО 1,23,железа 0,20.С. 8,5 кг гранулята экструдируюти сушат как в партии А после добавления 25 г ЫдО 50 г цитрата железа 111) и 250 г моногидрата декстрозы. Содержание ИдО 1,23, хелеэа0,40.О. 8,5 кг грубого гранулята обрабатывают как в партии С, но 50 гцитрата железа И 1) заменяют 30 гпирофосфата железа ИТТ с 12 железа. Содержание ИдО 1,23, железа0,18, 15Е. К 8,5 кг грубого гранулятадобавляют 25 г ИдО, 0,250 г моногидрата декстрозы и 30 г аммонийцитрата железа (111) с 15 железа. Послеперемешивания гранулят экструдируюти сушат как в партии А. СодержаниеИОО 1,23, хелеэа 0,22,Е, К последней партии в 8,5 кгдобавляют 26 г ИдО, 250 г моногидрата декстрозы и 30 г сульфата железа (11) и 30 железа. После тщательного перемешивания гранулятэкструдируют и сушат в партии А,Содержание ИдО 1,23, железа 0,44,Высушенные препараты просеивают .до размера 0,35-1 мм и анализируют,рН выходящего сиропа определяют через 20 и 43 ч,Результаты приведены в табл. 2Заметной разницы в активизациииспользованными солями железа не 35отмечается.П р и м е р 3. Опыты по изомеризации.Для следующих препаратов применяют грубый гранулированный осадок 40с фильтра в соответствии с примером 1.В осадке на фильтре содержится77,воды. 410/А нет добавления.410/В:2 ч. по весу смеси добавляют к98 ч. по весу сухогоосадка, Смесь содерхит 100 ч. декст;розы, 10 ч. ИдО и 12 ч. сульфатажелеза 111). 410/С: 7 ч по весусмеси добавляют к 93 чпо весусухого осадка на фильтре.1Затем смеси 410/А/С экструдируют через сито с отверстием,0,8 мм, сушат в кипящем слое до остаточной влажности 10. Определяютсодержание железа в готовых препа, ратах: 410/А 0,04, 410 В 0,08,410/С 0,18. Изомеризацию ведут свеществами из препаратов 410/А,410/В.и 410/С при следующих условиях: сироп45 по весу растворенной декстрозы, РН на входе 8,4+0,1,размер колонки Ь 40 см; д 5,8 см,Ид 0,0016 М, объем 1 л, температура 62 С, вес энзима 260 г,Энзим вымачивают 2 ч при комнат-ной температуре в указанном сиропе,но при рН 8,0, затем помецают вколонку. Получают. резулътаты, приведенные в табл. 3,Определяют концентрацию железав выходящем из этих колонок сиропе,Результаты приведены в табл. 4.Второй комплект опытов йо изомеризации проводят с веществами изпрепаратов 420/В, 410/С и 410/Апри следующих условиях: сироп - 45по весу растворенной декстрозы,рН на входе 8,40,1; Ид+ 0,0016 И;температура 65 фС, размер колонкиЬ 20 см; д 2,5 см, объем 100 мл,вес энзйма 20 .г, Энзим вымачивают1 ч при комнатной температуре вуказанном сиропе, затем загрухаютв колонку,Получают данные, приведенные в табл. 5.Определяют концентрацию железав выходяцем из этих колонок сиропе.)Результаты приведены в табл. 6.Определяют краску по С 1 Р Е выходящего сиропа. Результаты приведеныв табл. 7.Для определения сравнительнаяокраска по С 1 й Е для трех входящихсиропов эа этот период составляет0,019, 0,012 и 0,014Определяют стойкость окраскивыходящего из трех колонок сиропа.Результаты приведены в табл. 8.Для сравнения определяют стойкость окраски входящих сиропов заэтот период, которая равна 0,004,0,002 и 0,004.Содержание железа э энзимномпрепарате определяют до и после егоиспользования. Результаты приведены,в табл. 9.Пз табл, 9 видно, что содержание железа через 900 ч больше, чем в начале опыта, что объясняется поглощением железа знзимом из поступающего сиропа. Поскольку в сироп не Добавляют железа в этих опытах, оно образуется эа счет следов железа, присутствующего в растворе кристаллической декстроэы. Анализ 45-ного по весу декстрозного сиропа на елезо показал, что егб количество составляет .0,5 ч/мин, около 0,1 ч./млн. В течение 900 ч работы этих колонок через каждую из них, содержащую по 20 г энзима, проходит 75000 г сиропа. Если средняя концентрация 0,1 ч./млн, то обцая концентрация железа в сиропе 75000- 10-7 г =7,5 г. Это соответствует количеству железа, задержанному энзимом за время опыта.Добавление соли железаповышает активность без ухудшения стойкости и повышает производительность на 2 Я. Добавление меньших количеств,70 8 8 263 ИЯО и соли железа, как в 410/В,дает меньшее увелйчение рН на выходеи производительности, но и эти увеличения значительйыП р и м е р 4, Сравнение двух- итрехвалентного железа,К пробам грубо гранулированногоосадка на фильтре, полученногосогласно примеру 1, добавляют. смесьсоли железа, декстрозы и МдО. Затем смесь экструдируют через сеткус отверстиями 0,8 мм и сушат в кипящем слое до влажнОсти 10. Состави количество смеси соли железа,декстрозы и И 90 указаны в табл. 10.Анализ препаратов дал следуюциесодержание железа: 1 Ц 403 11 С0,22 ф 1 6 403 .110 О,27. Условияизомеризации: сироп - 45 по весурастворенной декстрозы," рН на выходе 8,4 ф 0,1, Идар+ 0,0016 И, темпе 8ратура 65 ф С, вес энзима 20 г, размер колонки и 20 см, д 2,5,У 100 мм.Энзим вымачивают 1 ч при комнатной температуре в этом сиропе и загружают в колонку., Результаты приведены в табл. 11. Содержание железа в энзимном препарате определяют до и после примене нияРезультаты приведены в табл, 12.В течение опыта содержание железа несколько увеличивается, чтоуказывает на сорбцию железа препаратами из следов железа в сиропе 15 декстрозы.Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать активированную и стабильную в процессе использования иммобилизованную глюкозоизомеразу,,8 229 410/С лиц та епарат 4 гох) 0 блица 5 Общаядлителностьопыта Препрат О/В 2 900 8,7 2 410./ 8 5 0 Б 7 8 10/А 19 0 б,8 ица а репара,017 9 б оличество железа в колонке, соде энзима Пре рез 900 ачале 41 4,410/ 10/А 14 а б ц а Декстроэа,Ъ Препар ия,Ъ ь железа ис ктивнос61 С/г Производительюсть 2 ХТ распад епарат ч 4 2093 е 0 4 46 1 О 27 Стойкость окраски Препарат,О ч вымачивание) 16 403 11 С 1,2 сульфатажелеза (111) 1 б 403 110 1,2 сульФатжелеза (11) Общая длительностьопыта, ч о,озб О,озб Таблица 11Препарат щщщщщ Составитель О. СкородумоваРедактор Н. Рогулич ТехредМ.Гергель Корректор С.В 1 екмар Заказ 4769/61 П "Патентф, г, Ужгород, ул. Проектная филиа 1 О 403 11 1 б 403 11 Тираж 523 ВНИИПИ Государственного к по делам изобретений и о 113035, Москва, Жщ 35, Рауш