Способ маркирования 11-й хромосомы человека, рекомбинантная плазмидная днк 53 для маркирования, фрагмент геномной днк 53 для маркирования и способ получения фрагмента днк 53 (original) (raw)
.сА,.сс ПИСАНИ БРЕТЕНИ леотидномеченой лярную гиб- ДНК мета- препаратов, ление мерагмента м их ок" ритием путет акции го за, реком ридиз мещения, бинатной ацию меных хромосоиоавтографи натурац К, мол й ДНК м, промывкуческое прояизованногос последующ ченого гибрна хромосомахрашиванием.2, РекомбтрНБ 53 длявания п и се Ие 11 П. ег а шпап гапс 1 еш 1 у отпояотпе-ярес 11984, тт.3 с.в -лимфоцитов ч 3. Фрагме из лимфоцито повторяющуюс алесфоидной Д леотидов с и ловека т гено мной ДНК рНБ 53 ека, включающий довательность ной 2546 пар нук- ательностью посл К, дл следа ОбясттстстбАООАТТТСОТТООААясбббятААясттсссАОААстАСАсб 64 АТОТТТОСАТТСААСТСАСАОАОТТОЯАССТТОСТТТСАТАОТТСАОСТТТСАЯАС 64 тАТТТООАССАстттбтббссттссттсбАААсГООт 414 тсттсАСАтс 444 ОтттсстттбАтОАстбсАттсААстсАсАОяаатаААсААтсстастбятбаябс ттстбсААОТООАТАтбтббясстГтбт 64464 тттстттббяяАсбббттсАтс АТТСТСАОА 44 СТОСТТТОТОА 16 ТТТОТОТТССАСТТСАООА 4 ТТАААСТТТССТ СРТЯТТСТАОЯАТСТОСАЯОТООЯГАТТТГсОАООАСТТТОЯООССТОТООТООАА АОЯТООААОСАТТСТСАОА 44 СТАСТТТОТОАТОАТТОСАТТС 04 СТСАСАОЯОТТ ОА 4 ТСТОСААОТООАТАТТТ ЯОСАТТОТОЯОА 44 СТТСТТТОТО АСТСТТТТТОТАОА 4 ТСТОСААОТО ССТАОЯССОААОСАТТСТСА 644 Т 40 ТТТТ 64 ААСТСТСТТТСТТТ 664 сттбАСАОАбсАОСТСТОААяссст 44664444 тсттсАсАтАААААст ТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕПЬСТ(71) Институт клинической психиатрии Всесоюзного научного центра психического здоровья АМН СССР(54) СПОСОБ МАРКИРОВАНИЯ 11-й ХРОМОСОМЬ ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рНБ 53 ДЛЯ МАРКИРОВАНИЯ,ФРАГМЕНТ ГЕНОМНОЙ ДНК рНБ 53 ДЛЯ МАР -КИРОВАИЯ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРАГМЕНТА ДНК рНБ 53.(57) 1. Способ маркирования 11-й хромосомы человека, включающий приготовление препаратов метафазных хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови человека, денатурацию хромосомной ДНК, радиоактивноемечение рекомбинатной ДНК рНБ 53 тнатттная плазмидная ДНК специфического маркирор т, нтромерного района 11-й хромосомы человека, резмером12500 пар нуклеотидов, состоящая из:большого Ряс 1 -фрагмента векторной плазмиды рКИоо 1 размером 10000 пар нуклеотидов, несущего ген устойчивости к тетрациклину, который представляет собой часть бактериальной плазмиды СоЕ и ограничен участками расщепления рестриктазами ЕсоК и Нра 1, и последовательность ДНК фага Мст, обуславливающую лизис чу ствительных клеток, ограниченную дву т 1 я участками расщепления рестриктазой ЕсоК 1;Ряг 1-фрагмента геномной ДНК из1203108БААсАттсстАтАБАтАБАОСАббттвтА 4 АсААтстттттбт 464 дтстасбАттавА 6 АтттаБАстбстттбАвасс тдстбтдбтдддабдддтддсттсдтстдддддссААдсиддвсдттсдсдбдсддттсттдбтвдтддттасдттбдт с ддсдвдбстбддсдттсстттдбдтввсвтдбтттссмдсдсдстттствтдвддтстбсддатидтдтттидст тстстбдидтттсвттидддсвидтдддсттсссдбддстдсдсавддбсдттбтадбдддсттстттбтвдтаттт бсдттсддстсдсдбдвттаддссттвстттсдтдаттсдастттсдддсдстстттттатввддтстасддбтаадтдт ттббдссдстттатббссттссттсбдддсбитдтдтсттсдсдтсдддсстдадссвддвсдттстсдбддтбтттсс татбдсвдстбсдттсддстсдсдвдбдтвддсддтсстастадтгвдасдвттттвдддстстстттстттавдттств сААбттбАтАтбтвбАсстствтОААОАтттсбттвбддАсбббттсАтсттсАсявАААААстА 4 яся 6446 слттстс дбдддстбстттбтбдтатттбтаттссдсттсддбмттбддстттсстсттвдсдвдвсдастгтадддссстстттт тстАБААтстбсяАОтббАс 4 тттббАбббстттбдббсстбтббтбс 44 ААООАА 44 тсттсАсАтАяАААстАОАтаа Адвсдттстсдвдддстдстттбтвдтбдттбсдттсбдстсдсдбдбттаддсдттсстдтдадтдвдбсдввттатяд дсддтстттттатдбддтствсбдттидбдтттббдстастттадвбсстдстбтдбтдддввдддтддсттсдтстдд ДАТССДААСВВААОСАТТСАСАО 4 С 4 АТТСТТАОТБАТААТТОСДТТОАТСТААСАОАОСТОАЯСЯТТССТТТАОАТ 66 С бтдбтттссдмсдсдстттстстдбддтстасддатбсдтдтттббдсттстстбдидтттсвттвбдддсбвадтдд дсттсссдбддстдсдсабддбсдттвтадбдддсттстттбтадтвтттвсдттсддстсдсдвдбттвддссттастт тсдтдаттсдбстттсдддсдстстттттбтвбддтстбсддатаадтдтттабдссдстттатаоссттссттсадддс витдтдтсттсдсдтсдддсстдадсдбддбсдттстсдбддтбтттсствтадсвдстбсдттсддстсдсдвдабтв ддсддссствстбдтвбдбсдвттттбдддстттстттабдттстбсддвтидтдтатидсстстатаддвдтттсат тбвдддсабтттсдтсттсдсдбдддддстдддсдабдбсдттстсдадддстастттбтбдтатттбтаттссдсттсд доддттбддстттсстсттвдсдбдбсдбстстбдддссстстттттстдвддтствсддвтавдсдтттидбввсттт бдисстатитимддиддддтсттсдсдтддмдстдбдтввддасдттстсдадддстдстттатвдтадттасд ттсбдстсдсдбдбттбддсдттсстдтдбдтдбдасдиттбтдмсддтвтттттатдаддтстбсбдттидадттт Ббдстастттбдвасстдстатдбтдддбвдддтддсттсдтстддмдссдддсабддасдттсдсдадсддттсттда тбдтсдттббдттбддстддсдадитбддсдттсстттдбдтабдаддвтттссддясдсдстттствсд генома человека. имеюций тандемную,организацию в геноме и кластеризованную локализациюв прицентромерном районе 1-й хромосомы человека и не участвующий всинтезе белка, для специфическогомаркирования 11-й хромосомы человека,Способ получения Фрагмента ДНК рНЯ 53, включающий эндонуклеазный гидролиз геномной ДНК из лимфоцитов человека рестриктазой РОС 1, лигирование полученных рестриктных Изобретение относится к медицинской генетике, в частности к области конструирования молекулярно-генетических маркеров, и может быть использовано для достоверной идентификации индивидуальных хромосом че - ловека в норме и патологии, включая пренатальную диагностику, а также для цитогенетического картирования Изобретение не имеет аналогов, так как предлагаемь 1 й способ.маркирования 11-й хромосомы человека разработан впервые. Пелью изобретения является создание молекулярно в генетическо Фрагментов в участке узнавания длярестриктазы Рзс 1 бактериальной плазмиды рКНоо 1 генетическую трансформапию клеток Е,со 1 НВ 101 рекомбинантной ДНК, селекцию рекомбинантных клонов, содержащих Фрагментыальфоидной ДНК по результатам гибридизации на колониях и идентификацию маркерного фрагмента путем молекулярной гибридизации на метафазныххромосомах человека в цитологических препаратах 1 п з 1 Сц. маркера 11-й хромосомы человека.Сущность изобретения заключается в том, что клонированный фрагмент ДНК рН 53 из лимфоцитов человека, представляющий собой повторяющуюся последовательность альфоидной ДНК человека, используется в качестве спепифического молекулярного маркера 11-й хромосомы человека. Данный Фрагмент имеет длину 2546. пар нуклеотидов и состоит из 15 альфоидных мономеров длиной 1 б 7-171 н.п,каж- . ды 1,), расположенньх тендемно, т,е, по типу 3 -конец предыдущего мономера к 5 . концу последующего мономера. Нолпый нуклеотидный текст Фрагмента рНВ 53 следующий;з2(.110 ч4аддтстосддаткдтдтттсодст тс 1 стаакдтттсаттаодддсокдтаддсттсссдадастдсдсоад аосдттотододддсттстттотадтотттасдттсддстсдсдадаттаадссттбстттсдтдоттсдостттсдддс дстстттттатдаддтстасддатоодтдтттаоассдстттатоогсттссттсоддасгт атдтдтгттсдсдтсддд сстдадссоддасдттстсдаддтатттсстттодтаастосдттсддстсдсдодоотаддсддтсстастодтаадас даттттодддстстстттсттткдттстасддотоодтдтотоаасстстотгддсдтттстттгодддсаоаттсдтс ттсдсдадддддстдддсдодаосдттстсдадддстастттатод гатттотаттссдсттсдооддттдддстттсст сттодсдодасдастстадддссстсттдттстдоддтстасддатсадгдтттоадкдстттадаасстотаатоада ддкддддтсттсдсдтдддддстдадткддасдттстсдодддстдстттотодтодттосдттсодстсдсдадотт аддсдттсстдтдаатдодосдкттотдддсддтстттттатдоддтстосадтткдсдтттагдстостттадгссс тдстотдотдддоадддтддсттсдтстдадддссдддсаоддосдттсдсдадсдаттсттдотодтддттасдттадт стддсдодастоддсдттсстттдадтксотдатттссдддсдсдстттстотдаддтстасддатаодтдтттаадст тстстодсадтттсоттоодддсакатдддсттсссдоддстдсдсооддасдттотададддсттстттатадтаттт осдттсддстсдсдадоттаддссттостттсдтдаттсдастттсдадсдстстттттатсаддтстосддаткдтдт ттоаяссястттстсоссттссттсаааасааотататсттсасдтсааасстааассадабсаттстсабадтотттсс татадсадстасдттсддстсдсдададтааясддтсстостодтгодосдаттттадддстстстттстттаодттста сддаттадтдтаткдсстстотадаодтттсотткдддскаттсдтсттсдсдадддддстдддсдаддасдттстс даддастастттатсдтотттатоттссасттсддаддттаддстттсстсттодсдадасдастг,тадддссстстттт тстдсддтстасддаткдсдтттаадкост ттодксстотаатосддддааддддтсттсдсдтдддддстдадтаа ддасдттстсдадддстдстттотадтодттосдттсадстсдсдадоттаддсдттсстдтдадтдодосдааттСтад дсадтстттттстдаддтстосодтткдадтттаадстастттадоасстдстотдотдддаодддтддсттсдтстдд ддтссдддскддасдттсдсдадсддттсттдатадтддттосдттодтстддсдодастаддсдттсстттдадтасс отдотттссдддсдсдстттстстдаддтстосддоткдтдтттоадсттстстодкдтттсаттоодддсокдтдд дсттсссдоддстдсдсааддасдттатадодддсттстттатодтотттосдттсддстсдсдодаттаддссттостт тсдтдоттсдастттсдддсдстстттттоткддтстасддаткдтат тткдссдстттатоассттссттсадддс ааатдтдтсттсдсдтсдддсстдадсдадаасдттстсдоддтатттсстатодсадстосдттсддстсдсдодСото ддсддссстастадтоааосаоттттадаастттсттткдттстосддатоадтдтаткдсстстотоддодтттсот ткадасоатттсдтсттсдсдаададдстдаасдкдасдттстсдадддстастттотгдтотттататтссдсттсд асадт таддстт тсстсттодсдадасасстстадддссстстттттстдаддтстасдаоткдсдттткдоаосттт ааассстотаатааддддоааддатсттсдсатададастяадтааадасдттстсдааддстдстттатадтааттася ттсаастсдсдадаттааасдттсстдтдадтдодасд Сттотдддсддтотттттотдадатстасадтткдодттт аадстастттадоссстдстотдотддакааатддсттсдтстдддддссдддсааддасдттсдсдадсддттсттда тодтсдттоадттодастддсдодастсддсдттсстттдадткдаддатттссдддсдсдстттстасдДанная последовательность нуклеотидов относится к классу альфоидной ДНК, т,е, обладает гомологией с Ы. - 30 фракцией сателлитоподобной ДНК африканской зеленой мартышкиПоследовательность содержит стоп-.кодоны во всех направлениях считывания, что прямо свидетельствует о том, что она 35 не кодирует белок,Источником выделения маркерного фрагмента рНБ 53 служит тотальная ДНК лимфоцитов человека, очищенная методом электрофильтрации на ультра фильтрующей мембране типа ХМ"Аппсоп". Препарат очищенной лимфоц 1 тарной ДНК человека (полученной от индивидов мужского пола) обрабаты вают рестриктазой Ряс до полного 45 гидролиза, Полученные рестриктные фрагменты вшивают" с помощью лигирования по "липким концам в Рзс - сайт бактериального плазмидного вектора рКИОО (12,5 т,п.н.). Данная 50 плазмида несет ген устойчивости к тетрациклину и фрагмент ДНК фаза ц (ген "К 111"), обуславливающий лизис чувствительных бактериальных клеток. Сайт Рзй рКМОО располагается в ра йоне этого гена Кь 11, что определяет нарушение работы данного гена в результате встройки любого фрагмента ДНК в данный сайт, Таким образом,тра 11 сформания лигазной смесью лианеризованной плазмиды и рестриктныхФрагментов ДНЕ человека) чувствительного к Мп-Фагу бактериального штамма(например НБ 10) автоматически определяет селекци 1 с только рекомбинантных трансформантов, Наличие гена устойчивости к Тс в плазмиде позволяета среде с этим антибиотиком отбиратьтолько трансформированные клетки, Таким Образом, данный вектор позволяетсоздать рекомбииантную клонотеку(т 1 о типу "з 1 ог 1-с цп") при автоматической селекции на среде с тетрациклином 1,Тс),На следую 11 ем этапе Б созданноиклонотеке ицентифидиРУют клоны Об -ладаюшие Гомологией с о(, ДНК, Дляэтого рекомбинантные клоны на нитроцеллюлозных Фильтрах вводят в реакцию гибридиза;ии с меченной радиоактив 1 И 1 м Фосфором ( Р) ДНК тотальной фракции АК в Д человека, котораяпредставлена, в основном, альфоидной ДНК. Колонии, )НК которых даетпозитивные рефлексы на радиоавтограФах в результате гибридизации, Отбирают и используют для определе 11 ияхромосомной локализацгп 1 клон 11 рова 11 И 11 хлих рестриктных Фрагментов ДНКчс опека непосредственно в цитолагичсских препаратах хромосом д.п адан,Для этого преиараты хромосом готовят из делящихся клеток в культуре лимфоцитав человека па известному5 методу., Стимулированные к делению с помощью Фитогемагглютинина 1, фирма Дифко", США) лимфоциты периферической крови культивируют в пеницилличовых флаконах при 37 С н среде Игла с 10 добавлением до 10% бычьей сыворотки в течение 74 ч. За час до концакультивирования вводят колхицин в концентрации 05 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в 15 центрифужные пробирки и центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотаническом растворе 0,07 М КС и инкубируют О мин при 37 С, Фиксацию проводят метанол уксусным Фиксатором (в соотношении 3.) трижды по 20 мин, Препараты хромосом хранят при 37 С и используют в опытах не позднее 2-3-х недель после приготовления. 2.)Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах 1 п зддд метят изатопнай меткой известным методом замещения: в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл де 30 сятикратного буферного раствора (0,8 М трис-НС 1, рН 7,4; О, М МдС 1 д);0,05 М дитиатреитал), 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярнай смеси (по З 5 0,01 ммоль каждого за исключением тимидинтрифасфата), 5 мкл ДНК-азы- (канцентрация 1 мкг/мл), 10 мкл Н- тимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/ммаль концентрация 5 мКи/мл , 10 мкл ДНК-полимеразы(концентрация 2 ед/мкл). Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию проводят 20-40 мин при 20 С. Средняя удельная радиоактивность ме ченых препаратов ДНК составляет около 25 х 1 Оь импульсов в минуту в расчете на 1 мкг ДНК,Гибридизацию меченной радиоактивными предшественниками рекомбинант" ной ДНК рНБ 53 с метафазными хромосомами 1 п зажги проводят па следующей методике; препараты метафазных хромосом денатурируют в течение30 с в 0,07 н,ИяОН с последующей промывкой по 10 мин в 70 и 96%-.нам этиловом спирте; препараты радиоактивных образцов ДНК денятурируют в гибридизационной смеси, содержащей 507 Формамида, 10% декстрансулъфата и стандартный солевой раствор (2 ББС), в течение 10 мин при 100 С; гибридизацию проводят при 37 С в течение 17-18 ч, Препараты после проведения гибридизации промывают в двухосменах 2 х ББС при 37 С, в двух сменах 2 х ББС при комнатной температуре, в 70 и 96%-ном этиловом спирте по 15 мин в каждой смене. После высушиванця на воздухе препараты покрывают фатоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 1 О дней, После проявления стандартным амидоловым проявителем препараты в течение 2 мин тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере ( рН 6,8в течение 10-15 мин, Рядиоавтаграфы анализируют и фотограФируют под микроскопом при увеличении 000" или 125".Гибридизация 1 п здп на метафазных хромосомах человека показывает,что клонированный Фрагмент рНБ 53локализован в прицентромерном районе11-й пары гамологичных хромосом человека и является таким образом специфическим молекулярным маркеромданной парь. хромосом,П р и м е р 1. Цельную гепаринизированную кровь от здорового донорамужского пола) разводят 0,15 МИаС 1в объемном соотношении 1;3, Для осаждения эритроцитов разведенную кровь смешивают с 6%-ным декстрансульфатомв соотношении 5:1, смесь отстаивают 30 мин при комнатной температуре; все последующие процедуры проводят при 0-4 С. Лейкоциты из надосадочной жидкости осаждают центрифугированием при 450 р в течение 20 мин и отмывают трехкратным центрифугировянием в 0,15 М ИаС 1 (450 д, 10 мин). Отмытые клетки ресуспендируют в, буФере СТМ, содержащем 0,5 М сахорозу, 50 мМ ряс НС 1 (рН 8,0), 5 мМ М 8 С 1, 0,2 мМ ЕНОТА с тритоном Хв конечной концентрации 0,5%. Фракцию ядер отмывают трехкратным центрифугированием в том же буфере без тритона Х(450 8, 10 мин).:дра ресуспендируют в буфере ТЕ ,50 мМ трис 1 С 1, рН 8,0; 5 мМ ГОТА) из расчета;100 мл буфера на 1 мл ядерного осадка и лизируют добавлением саркознля до концентрации 1%, 7 1203Лизат инкубируют при 65 С не менеео1 ч до полного просветления и центрифугируют 60 мин при 20000 об/миндля удаления механических примесей,Супернатант переносят в цилиндр, снизу закрытый ультрафильтром ХМ("Лппсоп"), На супернатант наслаивают равный объем буфера ТЕ + 17-ныйсаркозил. Жидкость, находящуюся вцилиндре, отделяют от анодной каме Оры диализной мембраной. Нижний крайцилиндра с фильтром опускают в катодную камеру;обе электродные камеры заполняют буАером,содержащим 89 мМ"тгйе НС 1,89 мМ Н ВО и 5 мМ ЕЭТЛ1 рН 8,3. Электрофильтрацию растворапроизводят при 5 мМ/см в течение 6-8 ч.После электрофоретического осаждения ДНК на фильтре жидкость удаляют из цилиндра, а желеобразныйслой ДНК растворяют в нужном объеме0,1 чТЕ,Для выделения препаративных количеств плазмидной ДНК культуру Е.со 1, несущую плазмиду, выращивают в25 100 мл среды В (10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л ИаС 1) с добавками необходимых антибиотиков (100 мкг/мл ампицилина, 20 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл хлорамфеникола) при 37 С на качалке в течение ночи. Клетки осаждают центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин) и ресуспендируют в 1 О мл раствора 50 мМ глюкозы, 50 мМ трИа -НС 1 (рН 35 8,0), 50 мИ ЕНОТА и 57 тритона Х, К суспензии добавляют свежеприготовленный раствор лизоцима до 5 мг/мл и оставляют при комнатной температуре на 10-15 мин. Затем объем пробы до водят до 50 мл буфером без лизоцима и помещают на ночь в термостат при 65 С, ДНК-мембранный комплекс и денатурированные белки клеток осаждают центрифугированием при 12000 об/мин 45 в течение 10 мин. К супернатанту добавляют 100 мкг/мл РНК-азы Л и после 2 ч инкубации при 65 С проводят фенольную, а затем хлороформную депротеинизацию, ДНК из раствора осаж дают равным объемом изопропиловогоспирта (-18 С, 20 мин), осадок растворяют в ТЕ. Раствор ДНК диализуют на сефадексе Спротив 0,1 х ББС (1 х ББС 18 г/л хлористого натрия 55 и 4,8 г/л цитрата натрия), Этот расатвор прогревают при 81 С в течение 10 мин и быстро охлаждают добавлением 1 ОЯ Яравного объема М КС 1+20 мМ Р 1 с".-НСрН 7,1 при О С. Полученную смесь пропускают через колонку с нитроцеллюлозой И 1 го-Се 11-Б(Бега) из расчета1 мг ДНК на 10 см объема колонки.Фракции, сожержащие кольцевые формыплазмидной ДРК, объединяют, ДНК изних осаждают равным объемом изопропилового спирта; осадок промывают50 Е-ным изопропиловым или 70 Е-пымэтиловым спиртом, высушивают под вакуумом и растворяют в буфере ТЕ донужной концентрации,ДНК рекомбинантных плазмид дляскрининга бактериальных клонов выделяют из 5 мл ночной культуры,осаждая центрифугированием при5000 об/мин в течение 10 мин, осадокресуспендируют в 1 мл 25 мМ трисНС (рН 8,0); 20 мМ ЕВТЛ, 50 мИ глюкозы и 2 мг/мл лизоцима с последуюшей инкубацией в течение 30 мин при0 С. К пробе добавляютмл раствора0,2 н.ИаОН с 1 ЮБ и после тщательного перемешпвания продолжают инкубацию 5 мин, К лпзату добавляют1,5 мл 3 М ацетата натрия, осторожно перемешивают раствор и оставляютна час при ОС. Образующийся осадок удаляют центрифугированием(2000 об/мпп, 20 мпн), нуклеиновыекислоты из супернатанта осаждаюто2,5 объемамп этилового сгирта (-18 С,30 мин), Осадок растворяют вмл50 м, тра -ПС 1 (рП 8,0) + 0,1 Мацетата натпя и переосаждают этанолом, Процедуру переосаждения повторяют дважды, конечный осадок послевысушивания растворяют в 100 мкл ТЕ,Эпдонук,;еазвую обработку ДНК человека и бактсриальпых плазмид проводят в буфере КЕВ, содержащем 10 мМгрие -НС 1 (рП 7,4), 10 мМ МеС 1 у,10 мМ ИаС 1 и 1 и,1 дитиотреитола (РТТ),Полный эндонуклеазный гидролиз ДНКдостигают при относительной концентрации рестриктаз 5-8 ед/мкг ДНКпосле проведения реакции в течение2 ч при 37 С, Реакцию останавливаютпрогреванием пробы при 70 С в течение 10 мин либо добавлением 1/4 объема смеси О,7-ного раствора БРБ,25 ь-ного раствора сахарозы, 5 мМацетат натрия и 0,05/-ного раствора брамфенолового синего.Для получения геномной клонотекиДНК человека в качестве вектора используют бактериальную плазмиду12031рК 1 оо 1, несущую ген устойчивости к тетрациклину, и последовательность Фага Мц, обуславливающую признак убийства", в которой расположен уникальный сайт для рестриктазы Рв 1:1. Данное сочетание позволяет проводить одноэтапный отбор рекомбинантных клонов при клонировании фрагмента ДНК человека в Рай-сайте плазмиды.Компетентную культуру бактерий для трансформации готовят следующим образом: в 25 мл питательной среды 1.В инокулируют 1 мл свежей ночной культуры Е.со 11 НВ 101 и выращивают на качалке при 37 С до мутности Ао =0,4-0,5. Деление клеток останавливают, помещая культуру на лед на 10-15 мин, с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 1 О мин на холоде, Осадок промывают равным объемом охлажденного до О С раствора 100 мМ СаС 1, клетки осаждают и ресуспендируют 12 мл 100 мМ СаС 1 . Клеточную суспензию выдерживают на холоду 20-30 мин, ) 4 центрифугируют, а осадок ресуспендируют в 2,5 мл 0,1 М СаС 1 с 5%-ным глицерином. После инкубации полученной суспензии при О С по крайней мере в течение 30 мин культура готова к трансформации, Культуру хранят в малых порциях при -80 С, при этом компетентность сохраняется по крайней мере в течение 4-5 месяцев.К 200 мкл компетентной культуры сйбактерий при 0 С добавляют 0,1 - 0,2 мкг лигированной ДНК и инкубируют при этой температуре в течение 45-60 мин. Затем смесь переносят в водяную баню (42 С) на 60-90 с и 40 снова помещают на лед. К трансформированной культуре добавляют питательный бульон .В и подращивают ее на качалке 2-3 ч при 37 С. Трансформанты высевают на плотную среду с д 1,5% агара (по 0,1 мл культуры на чашку Петри)и добавками необходимых антибиотиков, обуславливающих селекцию трансформированных клонов.30 мкл раствора, содержащего 0,1- 50 0,2 мкг плазмидной ДНК или 0,1 мкг препаративно выделенного из геляфрагмента и 1 мкл ДНК-азыв 0,015 М ЛаС 1, 5 мМ СаС 1 и 5 мМ МяС 1, инкубируют 10 мин при комнатной темпе ь ратуре, ДНК-азуинактивирую",. прио70 С, 10 мин после чего к раствору добавляют буферный раствор 0,4 М 08 1 ОТРис.-НС 1 (рН 7,4), 50 мМ И 8 С 1 т,25 мМ ВТТ ( до 1/5 конечного объемпо 1 н молю каждого из не меченыхпредшественников ДНК, 20-40 мкКи од 32ного из с( - Р-дезоксинуклеозидтрифосФатов с удельной активностью 10 ТВ(ммоль (3000 Ки/ммоль) (АтпегзЬатп) и1 ед.Д 1 К-полимеразы. Объем реакционной смеси как правило, составляет100 мкл, реакцию ведут в течение часа гри 37 С. Радиоактивность кислотонерастворимой Фракции ДНК измеряютна счетчике 1. КВ 215 по специальнойпрограмме, Средняя удельная активность меченых препаратов составляет2-5 х 1 О имп/мин/мкг ДНК,ЯДля идентификации вставок ДНК человека в составе гибридных клоновбактериальные колонии, предварит=льно тестированные по фенотипу как рекомбинантные, репликой наносят нанитроцеллюлозные фильтры (пп 11 роге,НАЫР), находящиеся непосредственнона поверхности твердой питательнойсреды в чашках Петри, и выращиваютих в течение суток при 37 С, Вьрос -шие колонии вмссте с фильтром переносят на поверхност раствога 0,5 М11 а 011 и оставляю- па 5-10 мин, Подсушив фи;и тр с нижней стороны с"зльтровальной бумагой, ег., дважды по 1 Оминобрабатывают раствогоми ТРМс -1 С(рН, 7,5) а затем ,5 И ИаС с 1 М1 РИс НС 1 (рН 7,5) Высушенный на воздухе Фильтр помещают в раствор2 х ББС с протеиназой К в концентрапии 50 мкг/мл и инкубируют в нем30 мин при 37 С. Далее подсушенныйФильтр промывают в 0,3 М ЫаС 1 а затем сушат под вакуумом при 80 С 12 ч,Перед гибридизацией Фильтр вымачивают при 68 С в растворе 2 х ББС,0,5: БОБ, 0,1% Фиколи 0,1% поливинилпирролидонв течение 6090 мин, Вслед за этим фильтр насухопромакивают фил:ьтровальной бумагой ипомещают в 4-5 мл гибридизационной смеси содержащей 6 х ББС, 0,1% БОБ,10% декстрансульфата, 50 мкг/млполи (А) и денатурированную пробу31 э1 -меченой ДНК с суммарной активностью.1 - 5 х Олимп/мин. Гибридизацию проводят при 68 С в течение 1824 с, Фильтры промывают в несколькихсменах раствора 0,5 х ББС с 0,5% БОБд спри 68 С в течение нескольких часов,Отмытые Фильтры окончательно высуши О:08 1вают и помещают н кассету с рентгеновской пленкой РМ. Через 2-24 чэкспозиции проявляют радиоавтографически и по наличию положительных сигналов (участков почернения округлойформы) идентифицируюг гибридныеклоны.Описанным способом ставят опыт натрех фильтрах-репликах с клонотекойРз 11 фрагментов ДНК человека. При 10этом в качестве зонда для гибридизации с колониями на фильтрах беретсяпроба альфоидной ДНК человека, выделенной препаративно из агарозногогеля после электрофоретического разделения гидролизата геномной ДНК человека эндонуклеазой Есор и идентификации полосы АК (340 н.п,), В указанный образец ДНК вводится изотопная метка описанным методом замещения, После гибридизации на колонияхположительный сигнал обнаруживаетсяособенно четко на двух колониях, однаиз которых получила название рНБ 53,Ьсоответственно ее порядковому номерув исходной клонотеке,Препараты хромосом готовят в культуре лимфоцитов периферической крови,стимулированных к делению с помощьюфитогемаглютинина (фирма "Дифко",США) в пенициллиновых флаконах при37 С в среде Игла с добавлением до10% бычьей сыворотки в течение 74 ч.За час до конца культивированиявводят колхицин в концентрации350,5 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в центрифужныепробирки и центрифугируют в течение5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе0,07 М КС 1 и инкубируют в течение10 мин при 37 С. Фиксацию проводятметанол-уксусным фиксатором (в соотношении 3:1) трижды по 20 мин. Преопараты хромосом хранят при 37 С ииспользуют в опытах не позднее 23-х недель после приготовления,Образцы ДНК для гибридизации нахромосомах п зСп метят.изотопнойметкой методом замещения: в 100 мкл 50деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратногобуферного раствора (0,8 М трос-НС 1,рН 7,4; 0,1 М М 8 С 1,ь, 0,05 М дитио,треитол , 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (,по 0,1 мМ ксаждого заисключением тимидинтрифосфата),5 л,кл ДК - азы(конпентрация1 ;кг/мл), О мкл Н-тимидинтрифосдата (удельная активность14 Ки/ммоль, концентрация 5 мКн/мл), 10 мкл ДНК-полимеразы(концентрацйя 2 ед/мкл), Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию ведут в течение 20-40 мин при 20 С. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25 х 10 импульсов в минуту в расчете на 1 мкг ДНК.Гибридизацию меченной радиоактивными предшественниками рекомбинантной ДНК рНБ 53 с метафазными хромосомами .и з 1 ц проводят с предварительной денатурацией в течение 30 с в 0,07 н ИаОН с последующей промывкой по 10 мин в 70 и 967-ном этиловом спирте, Препараты редиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 507формамида, 107 декстрансульфата и стандартный солевой раствор(2 х ЯЯС), в течение 10 мин при100 С. Гибридизацию проводят прио37 С в течение 17-18 ч, Препаратыпосле проведения гибридизации промывают в двух сменах 2 х БИС при 37 С, в двух сменах 2 х БЯС при комнатной температуре, в 70 и 967,-ном этиловом спирте по 15 мин в каждой смене,После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней, После проявления стандартных амидоловым проявителем в течение 2 минпрепараты тщательно промывают проточной водой и окрашивают 37.-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (рН 6,8) в течение 10-15 мин, Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении 100 илих1125Гибридизация 1 п здСц на метафазных хромосомах человека показывает,что клонированный фрагмент рНБ 53локализуется только в прицентромерном районе 11-пары гомологичных хромосом человека и является таким образом специфическим молекулярным маркером даннои пары хромосом,П р и м е р 2. Особенно важным является применение предлагаемого молекулярного маркера для распознавания 11-й хромосомы в тех случаях, когда эта хромосолга (один из3гомологов данной пары) затронута перестройкой, т.е, имеет потерю какого-либо участка или, напротив, добавку хромосомного материала, чтобудет сказываться на размере 11-йхромосомы и ее форме,Все процедуры по выделению образца ДНК рНБ 53 и его обработки с иэотопной меткой для гибридизации наметафазных хромосомах 1 п з 11 и, а так же все процедуры по приготовлениюпрепаратов метафазнь.х хромосом и проведению гибридизации на хромосомахповторяются аналогично примеру 1,Отличие состоит только в том, что впримере 1 используются препараты нормального хромосомного набора от здорового донора мужского пола, тогдакак в примере 2 используются препараты хромосомного набора женщины,являющейся носителем сбалднсировднной транслокации (переноса), терминальной трети короткого плеча 11-йхромосомы на конец длинного плеча8-й хромосомы, В результате такойтранслокации короткое плечо 1-й хромосомы значительно укорочено и приобычном визуальном осмотре метафазнойпластинки с данной перестройкой подмикроскопом диагностика указанного30нарушения требует высокого уровня,1 итогенетического анализа. Однакос помощью молекулярного маркерарНБ 53 для 11-й хромосомы гомологичный партнер с укороченным короткимплечом в этой паре легко распознает-ся непосредственно под микроскопом.П р и м е р 3, Важной иллюстрацией практического применения моле. кулярного маркера р 1 Б 53 для 11-й хромосомы является опыт по идентификации присутствия этой хромосомы в 40 клеточном ядре непосредственно покартине интерфазных (неделящихся)ядер, Как известно, хромосомы человека анализируются только в метафаземитоза после специальных обработокоблегчающих подсчет и анализ морфологии хромосом, Исключением является половая.Х-хромосома, наличие ко- .10торой в норме у женщин можно установить по наличию в интерфазном ядрекомпактного тельца полового хроматина, образованного одной из двухХ-хромосом в женском наборе, Однако 55с помощью молекулярного маркерарНБ 53, специфически маркирующеготолько 11-ю хромосому человека, наОЯлиние этой хромосомы в клеточномядре можно устанавливать без приготовления препаратов метафдзных хромо -сом, а только по анализу изображенийинтерфазных ядер, Это обусловленотем, что образец ДК рНБ 53 гибридизируется с НК припентромерногорайона 11-й хромосомы и в том случае,когда эта хромосома находится в расплетенном состоянии на стадии интерфазы. В этом случае в каждом интерФазном ядре можно видеть после гибридизации и приготовления радиоавтографов) два практически одинаковыхпо размеру скопления зерен серебрасигналов изотопной метки), еслигомологичные партнеры 11-й пары расположены в неделящемся ядре на достаточном расстоянии, или одно крупноескопление зерен метки, если оба партнера расположены поблизости.Все процедурь 1 по выделению образца ДИК рНБ 53 и его обработки с изотопной меткой для гибридизации наинтерфдзных ядрах а также все процедуры по приготовлению препаратовклеток из культуры лимфоцитов периферической крови повторяются аналогичнотаким же процедурам, описанньм в примерах 1 и 2. В каждом интерфазномядре обнаруживаются два крупных скопления гранул метки, соответствующихдвум гомологичным хромосомам 11-йпары. В разных ядрах расстояния между этими скоплениями различны. Такимобразом, появляется реальная воэможность впервые непосредственно в интерфазных ядрах анализировать расположение гомологичнь 1 х партнеров конкретной пары хромосом в клетках человека,что представляет большой научный интерес с точки зрения Функциональнойбрганизации наследственных структурчеловека,Таким образом, клонированная последовательность ДНК рНБ 53 иэ геномачеловека является эффективным инструментом для распознавания 11-й хромосомы человека как в стандартныхпрепаратах нормальных хромосомныхнаборов или в случаях с перестройками 11-й хромосомы, так и в препаратах интерфазных ядер, Укаэанные возможности расширяют область применения хромосомного анализа в прдктикемедико-генетического консультирования,включая пренатальную диагностику случаев с перестройками 11-йхромосомы человека. Возможно эффек16 1203108 Составитель ВГолимбетТехред А,Бойко Корректор, А Тяско Редактор Н,Егорова Заказ 8387/31 Тираж 524 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий1303, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5 Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 15тинное применение предлагаемого способа в анализе гибридных клеточных линий (человек-грызун), широко используемых для цитогенетическогокартирования нормальных и мутантныхгенов человека