Moriah Bertholet | University of Ottawa | Université d'Ottawa (original) (raw)
Drafts by Moriah Bertholet
Amiclenomycin is an amino acid antibiotic isolated from culture filtrates of Streptomyces lavendu... more Amiclenomycin is an amino acid antibiotic isolated from culture filtrates of Streptomyces lavendulae. Since it`s discovery, amiclenomycin has been found to exclusively halt the growth of Mycobacterium tuberculosis, through inhibition of the pyridoxal-5’-phosphate (PLP)-dependent enzyme 7,8-diaminopelargoonic acid synthase (DAPAS), an enzyme involved in biotin biosynthesis. There are many studies detailing the structural and mechanistic inactivation of DAPAS by amiclenomycin but there is little information on the exact biosynthetic pathway of the antibiotic in Streptomyces. Herein is a proposed biochemical scheme for the pathway, assembled through gene cluster analysis. The aim of this manuscript is to provide unwavering evidence of the suggested biochemical pathway, through biochemical assays. We start off by sequencing the recombinant expression plasmids, to confirm the presence of desired genes. Once confirmed, we proceed to correct a point deletion found in one gene, through site-directed mutagenesis. Then, we go to on to transform and isolate the expression plasmids. Finally, we induce the expression of the genes using IPTG (isoropyl β-D-1-thiogalactopyranoside). Our results do support the proposed hypothesis; however, additional biochemical assays will be needed to confidently confirm the pathway.
Suivant l'initiation de la transcription, l'ARN polymérase T7 rentre immédiatement dans une phase... more Suivant l'initiation de la transcription, l'ARN polymérase T7 rentre immédiatement dans une phase durant laquelle la dissociation du complexe tertiaire enzyme-promoteur-ARN, compétitionne de façon énergétique avec le processus d'élongation, un mécanisme appelé abortive cycling. Il a été démontré que ceci diminue la vitesse d'élongation (1). En introduisant une mutation à point semi-conservatrice, Y659F, dans la séquence codante de l'ARN polymérase T7, nous avons confirmé l'importance de ce résidu dans l'activité enzymatique de la polymérase. Le résidu Y650 de la protéine recombinante correspond au résidu Y639 de la protéine sauvage. Un essai enzymatique a été effectué avec l'ARN polymérase T7 de type sauvage (WT) et l'enzyme mutée, le MAT-ARN polymérase Y650F à l'aide d'un thermocycleur à temps réel. Les résultats démontrent que la mutante possède une activité enzymatique 2X plus élevée que le type sauvage. Cela prouve que le résidu Y650 joue un rôle essentiel dans la formation du complexe ainsi que dans le processus d'élongation. De plus, l'édition du groupement hydroxyle fonctionnel chez la Y650 augmente la vitesse de synthèse d'ARNm complète, soit en favorisant son affinité pour la séquences en aval du promoteur ou en promouvant la processivité.
L’isoforme M2 du pyruvate kinase (PKM2) est responsable de la conversion du phosphoénolpyruvate (... more L’isoforme M2 du pyruvate kinase (PKM2) est responsable de la conversion du phosphoénolpyruvate (PEP) en pyruvate. Cette étape est la dernière étape de catalyse dans le processus de glycolyse puis joue un rôle essentiel dans la fermentation lactique effectuée chez les cellules anaérobiques, notamment les cellules myocardiques. De plus, le pyruvate kinase joue un rôle important dans le métabolisme des cellules cancéreuses. Au cours de cette expérience, nous caractérisent une mutante (K422R) de la PKM2 à l’aide de dosages enzymatiques des deux formes de l’enzyme en présence de certains effecteurs étant déjà identifiés comme régulateurs allostérique de la PKM2. La mutation a été confirmée à l’aide de séquençage et alignement de séquence avec la séquence protéique de la PKM2, retrouvée sur NCBI. Nos résultats démontrent que la mutation K422R favorise l’état T tétramérique et inactive de la PKM2 à cause de formation de liens stabilisantes au sein de la structure globulaire. La PKM2, sous sa forme active, existe plutôt sous l’état R tétramérique (3). Notre étude met en évidence une façon efficace de réguler l’activité enzymatique de la PKM2 à travers un changement dans la structure cristalline du type sauvage. Cette information s’avère utile pour des études dans le traitement du cancer qui vise à inhiber la fonction de la PKM2.
Amiclenomycin is an amino acid antibiotic isolated from culture filtrates of Streptomyces lavendu... more Amiclenomycin is an amino acid antibiotic isolated from culture filtrates of Streptomyces lavendulae. Since it`s discovery, amiclenomycin has been found to exclusively halt the growth of Mycobacterium tuberculosis, through inhibition of the pyridoxal-5’-phosphate (PLP)-dependent enzyme 7,8-diaminopelargoonic acid synthase (DAPAS), an enzyme involved in biotin biosynthesis. There are many studies detailing the structural and mechanistic inactivation of DAPAS by amiclenomycin but there is little information on the exact biosynthetic pathway of the antibiotic in Streptomyces. Herein is a proposed biochemical scheme for the pathway, assembled through gene cluster analysis. The aim of this manuscript is to provide unwavering evidence of the suggested biochemical pathway, through biochemical assays. We start off by sequencing the recombinant expression plasmids, to confirm the presence of desired genes. Once confirmed, we proceed to correct a point deletion found in one gene, through site-directed mutagenesis. Then, we go to on to transform and isolate the expression plasmids. Finally, we induce the expression of the genes using IPTG (isoropyl β-D-1-thiogalactopyranoside). Our results do support the proposed hypothesis; however, additional biochemical assays will be needed to confidently confirm the pathway.
Suivant l'initiation de la transcription, l'ARN polymérase T7 rentre immédiatement dans une phase... more Suivant l'initiation de la transcription, l'ARN polymérase T7 rentre immédiatement dans une phase durant laquelle la dissociation du complexe tertiaire enzyme-promoteur-ARN, compétitionne de façon énergétique avec le processus d'élongation, un mécanisme appelé abortive cycling. Il a été démontré que ceci diminue la vitesse d'élongation (1). En introduisant une mutation à point semi-conservatrice, Y659F, dans la séquence codante de l'ARN polymérase T7, nous avons confirmé l'importance de ce résidu dans l'activité enzymatique de la polymérase. Le résidu Y650 de la protéine recombinante correspond au résidu Y639 de la protéine sauvage. Un essai enzymatique a été effectué avec l'ARN polymérase T7 de type sauvage (WT) et l'enzyme mutée, le MAT-ARN polymérase Y650F à l'aide d'un thermocycleur à temps réel. Les résultats démontrent que la mutante possède une activité enzymatique 2X plus élevée que le type sauvage. Cela prouve que le résidu Y650 joue un rôle essentiel dans la formation du complexe ainsi que dans le processus d'élongation. De plus, l'édition du groupement hydroxyle fonctionnel chez la Y650 augmente la vitesse de synthèse d'ARNm complète, soit en favorisant son affinité pour la séquences en aval du promoteur ou en promouvant la processivité.
L’isoforme M2 du pyruvate kinase (PKM2) est responsable de la conversion du phosphoénolpyruvate (... more L’isoforme M2 du pyruvate kinase (PKM2) est responsable de la conversion du phosphoénolpyruvate (PEP) en pyruvate. Cette étape est la dernière étape de catalyse dans le processus de glycolyse puis joue un rôle essentiel dans la fermentation lactique effectuée chez les cellules anaérobiques, notamment les cellules myocardiques. De plus, le pyruvate kinase joue un rôle important dans le métabolisme des cellules cancéreuses. Au cours de cette expérience, nous caractérisent une mutante (K422R) de la PKM2 à l’aide de dosages enzymatiques des deux formes de l’enzyme en présence de certains effecteurs étant déjà identifiés comme régulateurs allostérique de la PKM2. La mutation a été confirmée à l’aide de séquençage et alignement de séquence avec la séquence protéique de la PKM2, retrouvée sur NCBI. Nos résultats démontrent que la mutation K422R favorise l’état T tétramérique et inactive de la PKM2 à cause de formation de liens stabilisantes au sein de la structure globulaire. La PKM2, sous sa forme active, existe plutôt sous l’état R tétramérique (3). Notre étude met en évidence une façon efficace de réguler l’activité enzymatique de la PKM2 à travers un changement dans la structure cristalline du type sauvage. Cette information s’avère utile pour des études dans le traitement du cancer qui vise à inhiber la fonction de la PKM2.