Evangelos Bisyris | University of Patras (original) (raw)
Papers by Evangelos Bisyris
Pharmaceutics, Apr 30, 2022
This article is an open access article distributed under the terms and conditions of the Creative... more This article is an open access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution (CC BY
<jats:p>Στην παρούσα διδακτορική διατριβή περιγράφεται ο σχεδιασμός και η σύνθεση ενός νέου... more <jats:p>Στην παρούσα διδακτορική διατριβή περιγράφεται ο σχεδιασμός και η σύνθεση ενός νέου ιχνηθέτη ενεργότητας (activity-based probe, ABP) και αναστολέων ειδικών για την καλλικρεΐνη 7 (KLK7), καθώς και η αποτίμηση των θεραπευτικών ιδιοτήτων τους in vivo. Η KLK7 είναι μία σερινοπρωτεάση η οποία έχει μελετηθεί ιδιαίτερα για τον ενεργό της ρόλο στην φλεγμονή και την αποφολίδωση του δέρματος, καθώς και σε διάφορους τύπους καρκίνου. Οι ιχνηθέτες ενεργότητας (ABPs) είναι μικρά μόρια ικανά να αναγνωρίζουν ειδικά τις καταλυτικώς ενεργές μορφές των ενζύμων. Η ιδιότητά τους αυτή, τους καθιστά μοναδικά και ιδιαίτερα χρήσιμα εργαλεία για την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση του ενεργού κλάσματος του ενζύμου, καθώς επίσης και για την in vivo απεικόνιση της ενζυμικής δραστηριότητας, με πολυάριθμες εφαρμογές στην βιοχημική ανάλυση, αλλά και στην μοριακή διάγνωση. Σημειώνεται ότι τα αντισώματα, που χρησιμοποιούνται στις διάφορες ανοσοδοκιμές, αναγνωρίζουν την ολική ποσότητα του ενζύμου στην οποία περιλαμβάνονται και ενζυμικώς ανενεργές μορφές, όπως για παράδειγμα προένζυμα, σύμπλοκα ενζύμου-αναστολέα, κολοβωμένες πρωτεΐνες που έχουν απωλέσει την ενζυμική ενεργότητα, κλπ. Για τον σχεδιασμό του ιχνηθέτη της KLK7 εφαρμόσαμε μια in silico προσέγγιση για τον προσδιορισμό ενός νέου υποστρώματος ειδικού για την KLK7. Τροποποίηση του πεπτιδικού υποστρώματος έδωσε τον φωσφωνικό αναστολέα (Boc-Phe-PheP-(OPh)2), ειδικό για την KLK7, ενώ ο ειδικός ιχνηθέτης ενεργότητας (biotin-X-X-Phe-PheP-(OPh)2) παρήχθη με βιοτινυλίωση του αναστολέα. Επιπλέον, συντέθηκε ένας ιχνηθέτης ABP με απόσβεση φθορισμού (KLK7-qABP, όπου q: quenched), ο οποίος αξιολογήθηκε in vitro με καθιερωμένες αναλυτικές μεθόδους, αλλά και με μία νέα μεθοδολογία ιστοχημικής ανάλυσης ενζύμων, την ακτιβογραφία (activography) (Pampalakis et al., Chem Commun (Camb) 53: 3246-3248, 2017). Πειραματικά δείχθηκε ότι ο ιχνηθέτης KLK7-ABP ανιχνεύει την ενεργή μορφή της ανθρώπινης KLK7, καθώς και την ενδογενή ανθρώπινη KLK7 και την Klk7 του ποντικού, σε εκχυλίσματα κυττάρων και βιοψίες δέρματος, αντίστοιχα. Οι θεραπευτικές δυνατότητες του αναστολέα και του ιχνηθέτη της KLK7 καταδείχθηκαν in vivo χρησιμοποιώντας ποντικούς Spink5-/-Klk5-/-. Το σύνδρομο Netherton είναι μια (ενίοτε θανατηφόρα) μορφή ιχθύωσης, η οποία χαρακτηρίζεται από παθολογική υπεραποφολίδωση του δέρματος και ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένη φλεγμονή στην επιδερμίδα, με αποτέλεσμα την εκτεταμένη βλάβη του δερματικού φραγμού. Η νόσος οφείλεται στην ανεπάρκεια του αναστολέα σερινοπρωτεασών LEKTI λόγω μεταλλάξεων στο αντίστοιχο γονίδιο SPINK5, με αποτέλεσμα την έκτοπη ενεργοποίηση της πρωτεόλυσης στην επιδερμίδα των ασθενών με σύνδρομο Netherton, αλλά και των ποντικών Spink5-/- που αναπαράγουν την ανθρώπινη νόσο, και αποτελούν καθιερωμένο πρότυπο για την μελέτη του συνδρόμου Netherton και της ατοπικής δερματίτιδας. Επίσης, έχει δειχθεί ότι η πρωτεάση KLK7 είναι ενεργοποιημένη στο δέρμα των ποντικών Spink5-/-Klk5-/-, στους οποίους έχει αδρανοποιηθεί η πρωτεάση Klk5, και εμπλέκεται αιτιολογικά στην παθολογία του δέρματος (Furio et al., 2015; Kasparek el al., 2017). Επομένως οι ποντικοί αυτοί αποτελούν ιδανικό πρότυπο για την δοκιμή και αξιολόγηση αναστολέων της πρωτεάσης Klk7. Επιδερμική χορήγηση τόσο του αναστολέα όσο και του ABP της KLK7 εξασθένισε σημαντικά την φλεγμονή και την υπεραποφολίδωση του δέρματος. Τα δεδομένα αυτά παρέχουν προκλινικές ενδείξεις για την δυνητική θεραπευτική και διαγνωστική (θεραποδιαγνωστική / therapeutic and diagnostic: theranostic) χρήση του KLK7-ABP σε δερματικές παθολογίες, καθώς και σε καρκίνους των ωοθηκών και του παγκρέατος, όπου επίσης εμπλέκεται η KLK7. Με την ίδια στρατηγική αναπτύχθηκε ένας ΑΒΡ για την KLK6 (biotin-dPEG®4-His-Ile-Val-ArgP-(OPh)2) με σκοπό την ανίχνευση και ποσοτικό προσδιορισμό της ενεργούς KLK6 σε βιολογικά και κλινικά δείγματα, δεδομένου ότι η KLK6 εμπλέκεται στις νόσους Alzheimer και Parkinson, καθώς και σε διάφορους τύπους καρκίνων. Μέχρι σήμερα, ο ρόλος θεραποδιαγνωστικών ABPs για τις κυστεϊνοπρωτεϊνάσες καθεψίνες έχει μελετηθεί και αξιολογηθεί σε καρκίνους και καρδιαγγειακές παθήσεις (Ben-Nun et al., 2015; Weiss-Sadan et al., 2019). Στην παρούσα διατριβή, για πρώτη φορά αναπτύχθηκαν και αξιολογήθηκαν νέοι αναστολείς-ABPs για την KLK7 (Bisyris et al, 2021a and 2021b) και την KLK6 με διττές λειτουργίες φιλοξενούμενες σε έναν πεπτιδικό σκελετό, δηλαδή αναστολέα και ιχνηθέτη, και με ποικίλες δυνατές θεραποδιαγνωστικές εφαρμογές. Η εφαρμογή τους στην στόχευση των καλλικρεϊνών, την μεγαλύτερη οικογένεια σερινοπρωτεασών του ανθρώπινου γονιδιώματος, η οποία καταδείχθηκε στην παρούσα διατριβή, διευρύνει γενικότερα την χρήση των ABPs ως θεραποδιαγνωστικών μέσων (theranostic agents).</jats:p>
Pharmaceutics
Proteases are important enzymes in health and disease. Their activities are regulated at multiple... more Proteases are important enzymes in health and disease. Their activities are regulated at multiple levels. In fact, proteases are synthesized as inactive proenzymes (zymogens) that are activated by proteolytic removal of their pro-peptide sequence and can remain active or their activity can be attenuated by complex formation with specific endogenous inhibitors or by limited proteolysis or degradation. Consequently, quite often, only a fraction of the protease molecules is in the active/functional form, thus, the abundance of a protease is not always linearly proportional to the (patho)physiological function(s). Therefore, assays to determine the active forms of proteases are needed, not only in research but also in molecular diagnosis and therapy. Activity-based probes (ABPs) are chemical entities that bind covalently to the active enzyme/protease. ABPs carry a detection tag to enable localization and quantification of specific enzymatic/proteolytic activities with applications in mo...
Chemical Communications, 2021
Enzyme specific inhibitors can be designed based on endogenous substrate peptide motifs and modif... more Enzyme specific inhibitors can be designed based on endogenous substrate peptide motifs and modified to yield specific activity-based probes (ABPs). The development/validation of a theranostic ABP-inhibitor prototype for KLK7 protease is presented.
Organic & Biomolecular Chemistry, 2021
A mixed alkyl aryl phosphonate qABP for KLK7 was developed where the internally-quenching system ... more A mixed alkyl aryl phosphonate qABP for KLK7 was developed where the internally-quenching system is realeased upon binding of the qABP to the active enzyme.
<jats:p>Στην παρούσα διδακτορική διατριβή περιγράφεται ο σχεδιασμός και η σύνθεση ενός νέου... more <jats:p>Στην παρούσα διδακτορική διατριβή περιγράφεται ο σχεδιασμός και η σύνθεση ενός νέου ιχνηθέτη ενεργότητας (activity-based probe, ABP) και αναστολέων ειδικών για την καλλικρεΐνη 7 (KLK7), καθώς και η αποτίμηση των θεραπευτικών ιδιοτήτων τους in vivo. Η KLK7 είναι μία σερινοπρωτεάση η οποία έχει μελετηθεί ιδιαίτερα για τον ενεργό της ρόλο στην φλεγμονή και την αποφολίδωση του δέρματος, καθώς και σε διάφορους τύπους καρκίνου. Οι ιχνηθέτες ενεργότητας (ABPs) είναι μικρά μόρια ικανά να αναγνωρίζουν ειδικά τις καταλυτικώς ενεργές μορφές των ενζύμων. Η ιδιότητά τους αυτή, τους καθιστά μοναδικά και ιδιαίτερα χρήσιμα εργαλεία για την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση του ενεργού κλάσματος του ενζύμου, καθώς επίσης και για την in vivo απεικόνιση της ενζυμικής δραστηριότητας, με πολυάριθμες εφαρμογές στην βιοχημική ανάλυση, αλλά και στην μοριακή διάγνωση. Σημειώνεται ότι τα αντισώματα, που χρησιμοποιούνται στις διάφορες ανοσοδοκιμές, αναγνωρίζουν την ολική ποσότητα του ενζύμου στην οποία περιλαμβάνονται και ενζυμικώς ανενεργές μορφές, όπως για παράδειγμα προένζυμα, σύμπλοκα ενζύμου-αναστολέα, κολοβωμένες πρωτεΐνες που έχουν απωλέσει την ενζυμική ενεργότητα, κλπ. Για τον σχεδιασμό του ιχνηθέτη της KLK7 εφαρμόσαμε μια in silico προσέγγιση για τον προσδιορισμό ενός νέου υποστρώματος ειδικού για την KLK7. Τροποποίηση του πεπτιδικού υποστρώματος έδωσε τον φωσφωνικό αναστολέα (Boc-Phe-PheP-(OPh)2), ειδικό για την KLK7, ενώ ο ειδικός ιχνηθέτης ενεργότητας (biotin-X-X-Phe-PheP-(OPh)2) παρήχθη με βιοτινυλίωση του αναστολέα. Επιπλέον, συντέθηκε ένας ιχνηθέτης ABP με απόσβεση φθορισμού (KLK7-qABP, όπου q: quenched), ο οποίος αξιολογήθηκε in vitro με καθιερωμένες αναλυτικές μεθόδους, αλλά και με μία νέα μεθοδολογία ιστοχημικής ανάλυσης ενζύμων, την ακτιβογραφία (activography) (Pampalakis et al., Chem Commun (Camb) 53: 3246-3248, 2017). Πειραματικά δείχθηκε ότι ο ιχνηθέτης KLK7-ABP ανιχνεύει την ενεργή μορφή της ανθρώπινης KLK7, καθώς και την ενδογενή ανθρώπινη KLK7 και την Klk7 του ποντικού, σε εκχυλίσματα κυττάρων και βιοψίες δέρματος, αντίστοιχα. Οι θεραπευτικές δυνατότητες του αναστολέα και του ιχνηθέτη της KLK7 καταδείχθηκαν in vivo χρησιμοποιώντας ποντικούς Spink5-/-Klk5-/-. Το σύνδρομο Netherton είναι μια (ενίοτε θανατηφόρα) μορφή ιχθύωσης, η οποία χαρακτηρίζεται από παθολογική υπεραποφολίδωση του δέρματος και ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένη φλεγμονή στην επιδερμίδα, με αποτέλεσμα την εκτεταμένη βλάβη του δερματικού φραγμού. Η νόσος οφείλεται στην ανεπάρκεια του αναστολέα σερινοπρωτεασών LEKTI λόγω μεταλλάξεων στο αντίστοιχο γονίδιο SPINK5, με αποτέλεσμα την έκτοπη ενεργοποίηση της πρωτεόλυσης στην επιδερμίδα των ασθενών με σύνδρομο Netherton, αλλά και των ποντικών Spink5-/- που αναπαράγουν την ανθρώπινη νόσο, και αποτελούν καθιερωμένο πρότυπο για την μελέτη του συνδρόμου Netherton και της ατοπικής δερματίτιδας. Επίσης, έχει δειχθεί ότι η πρωτεάση KLK7 είναι ενεργοποιημένη στο δέρμα των ποντικών Spink5-/-Klk5-/-, στους οποίους έχει αδρανοποιηθεί η πρωτεάση Klk5, και εμπλέκεται αιτιολογικά στην παθολογία του δέρματος (Furio et al., 2015; Kasparek el al., 2017). Επομένως οι ποντικοί αυτοί αποτελούν ιδανικό πρότυπο για την δοκιμή και αξιολόγηση αναστολέων της πρωτεάσης Klk7. Επιδερμική χορήγηση τόσο του αναστολέα όσο και του ABP της KLK7 εξασθένισε σημαντικά την φλεγμονή και την υπεραποφολίδωση του δέρματος. Τα δεδομένα αυτά παρέχουν προκλινικές ενδείξεις για την δυνητική θεραπευτική και διαγνωστική (θεραποδιαγνωστική / therapeutic and diagnostic: theranostic) χρήση του KLK7-ABP σε δερματικές παθολογίες, καθώς και σε καρκίνους των ωοθηκών και του παγκρέατος, όπου επίσης εμπλέκεται η KLK7. Με την ίδια στρατηγική αναπτύχθηκε ένας ΑΒΡ για την KLK6 (biotin-dPEG®4-His-Ile-Val-ArgP-(OPh)2) με σκοπό την ανίχνευση και ποσοτικό προσδιορισμό της ενεργούς KLK6 σε βιολογικά και κλινικά δείγματα, δεδομένου ότι η KLK6 εμπλέκεται στις νόσους Alzheimer και Parkinson, καθώς και σε διάφορους τύπους καρκίνων. Μέχρι σήμερα, ο ρόλος θεραποδιαγνωστικών ABPs για τις κυστεϊνοπρωτεϊνάσες καθεψίνες έχει μελετηθεί και αξιολογηθεί σε καρκίνους και καρδιαγγειακές παθήσεις (Ben-Nun et al., 2015; Weiss-Sadan et al., 2019). Στην παρούσα διατριβή, για πρώτη φορά αναπτύχθηκαν και αξιολογήθηκαν νέοι αναστολείς-ABPs για την KLK7 (Bisyris et al, 2021a and 2021b) και την KLK6 με διττές λειτουργίες φιλοξενούμενες σε έναν πεπτιδικό σκελετό, δηλαδή αναστολέα και ιχνηθέτη, και με ποικίλες δυνατές θεραποδιαγνωστικές εφαρμογές. Η εφαρμογή τους στην στόχευση των καλλικρεϊνών, την μεγαλύτερη οικογένεια σερινοπρωτεασών του ανθρώπινου γονιδιώματος, η οποία καταδείχθηκε στην παρούσα διατριβή, διευρύνει γενικότερα την χρήση των ABPs ως θεραποδιαγνωστικών μέσων (theranostic agents).</jats:p>
Org. Biomol. Chem., 2021, 19, 6834–6841, 2021
Kallikrein 7 (KLK7) is a chymotrypsin-like serine protease with established roles in skin disease... more Kallikrein 7 (KLK7) is a chymotrypsin-like serine protease with established roles in skin diseases like the rare Netherton syndrome, an overdesquamating and inflammatory condition, but also common atopic dermatitis, and a potential drug target for these and possibly other diseases. Nevertheless, tools to determine the active KLK7 enzyme are not available. Here, a mixed alkyl aryl phosphonate quenched activitybased probe that detects the active KLK7 was developed and evaluated in vitro. This KLK7-qABP can potentially be used to monitor KLK7 activity in vivo. † Electronic supplementary information (ESI) available. See
Chem. Commun., 2021, 57, 6507–6510 , 2021
We applied a new in silico approach for using protease-substrate motifs to design a kallikrein 7 ... more We applied a new in silico approach for using protease-substrate motifs to design a kallikrein 7 (KLK7)-specific phosphonate activity-based probe (ABP) to quantify the active KLK7 in situ. Epidermal application of the ABP-inhibitor on Spink5 À/À Klk5 À/À mice, a Netherton syndrome model, reversed disease hallmarks, providing preclinical proof-ofconcept for using ABPs as theranostics.
Pharmaceutics, Apr 30, 2022
This article is an open access article distributed under the terms and conditions of the Creative... more This article is an open access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution (CC BY
<jats:p>Στην παρούσα διδακτορική διατριβή περιγράφεται ο σχεδιασμός και η σύνθεση ενός νέου... more <jats:p>Στην παρούσα διδακτορική διατριβή περιγράφεται ο σχεδιασμός και η σύνθεση ενός νέου ιχνηθέτη ενεργότητας (activity-based probe, ABP) και αναστολέων ειδικών για την καλλικρεΐνη 7 (KLK7), καθώς και η αποτίμηση των θεραπευτικών ιδιοτήτων τους in vivo. Η KLK7 είναι μία σερινοπρωτεάση η οποία έχει μελετηθεί ιδιαίτερα για τον ενεργό της ρόλο στην φλεγμονή και την αποφολίδωση του δέρματος, καθώς και σε διάφορους τύπους καρκίνου. Οι ιχνηθέτες ενεργότητας (ABPs) είναι μικρά μόρια ικανά να αναγνωρίζουν ειδικά τις καταλυτικώς ενεργές μορφές των ενζύμων. Η ιδιότητά τους αυτή, τους καθιστά μοναδικά και ιδιαίτερα χρήσιμα εργαλεία για την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση του ενεργού κλάσματος του ενζύμου, καθώς επίσης και για την in vivo απεικόνιση της ενζυμικής δραστηριότητας, με πολυάριθμες εφαρμογές στην βιοχημική ανάλυση, αλλά και στην μοριακή διάγνωση. Σημειώνεται ότι τα αντισώματα, που χρησιμοποιούνται στις διάφορες ανοσοδοκιμές, αναγνωρίζουν την ολική ποσότητα του ενζύμου στην οποία περιλαμβάνονται και ενζυμικώς ανενεργές μορφές, όπως για παράδειγμα προένζυμα, σύμπλοκα ενζύμου-αναστολέα, κολοβωμένες πρωτεΐνες που έχουν απωλέσει την ενζυμική ενεργότητα, κλπ. Για τον σχεδιασμό του ιχνηθέτη της KLK7 εφαρμόσαμε μια in silico προσέγγιση για τον προσδιορισμό ενός νέου υποστρώματος ειδικού για την KLK7. Τροποποίηση του πεπτιδικού υποστρώματος έδωσε τον φωσφωνικό αναστολέα (Boc-Phe-PheP-(OPh)2), ειδικό για την KLK7, ενώ ο ειδικός ιχνηθέτης ενεργότητας (biotin-X-X-Phe-PheP-(OPh)2) παρήχθη με βιοτινυλίωση του αναστολέα. Επιπλέον, συντέθηκε ένας ιχνηθέτης ABP με απόσβεση φθορισμού (KLK7-qABP, όπου q: quenched), ο οποίος αξιολογήθηκε in vitro με καθιερωμένες αναλυτικές μεθόδους, αλλά και με μία νέα μεθοδολογία ιστοχημικής ανάλυσης ενζύμων, την ακτιβογραφία (activography) (Pampalakis et al., Chem Commun (Camb) 53: 3246-3248, 2017). Πειραματικά δείχθηκε ότι ο ιχνηθέτης KLK7-ABP ανιχνεύει την ενεργή μορφή της ανθρώπινης KLK7, καθώς και την ενδογενή ανθρώπινη KLK7 και την Klk7 του ποντικού, σε εκχυλίσματα κυττάρων και βιοψίες δέρματος, αντίστοιχα. Οι θεραπευτικές δυνατότητες του αναστολέα και του ιχνηθέτη της KLK7 καταδείχθηκαν in vivo χρησιμοποιώντας ποντικούς Spink5-/-Klk5-/-. Το σύνδρομο Netherton είναι μια (ενίοτε θανατηφόρα) μορφή ιχθύωσης, η οποία χαρακτηρίζεται από παθολογική υπεραποφολίδωση του δέρματος και ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένη φλεγμονή στην επιδερμίδα, με αποτέλεσμα την εκτεταμένη βλάβη του δερματικού φραγμού. Η νόσος οφείλεται στην ανεπάρκεια του αναστολέα σερινοπρωτεασών LEKTI λόγω μεταλλάξεων στο αντίστοιχο γονίδιο SPINK5, με αποτέλεσμα την έκτοπη ενεργοποίηση της πρωτεόλυσης στην επιδερμίδα των ασθενών με σύνδρομο Netherton, αλλά και των ποντικών Spink5-/- που αναπαράγουν την ανθρώπινη νόσο, και αποτελούν καθιερωμένο πρότυπο για την μελέτη του συνδρόμου Netherton και της ατοπικής δερματίτιδας. Επίσης, έχει δειχθεί ότι η πρωτεάση KLK7 είναι ενεργοποιημένη στο δέρμα των ποντικών Spink5-/-Klk5-/-, στους οποίους έχει αδρανοποιηθεί η πρωτεάση Klk5, και εμπλέκεται αιτιολογικά στην παθολογία του δέρματος (Furio et al., 2015; Kasparek el al., 2017). Επομένως οι ποντικοί αυτοί αποτελούν ιδανικό πρότυπο για την δοκιμή και αξιολόγηση αναστολέων της πρωτεάσης Klk7. Επιδερμική χορήγηση τόσο του αναστολέα όσο και του ABP της KLK7 εξασθένισε σημαντικά την φλεγμονή και την υπεραποφολίδωση του δέρματος. Τα δεδομένα αυτά παρέχουν προκλινικές ενδείξεις για την δυνητική θεραπευτική και διαγνωστική (θεραποδιαγνωστική / therapeutic and diagnostic: theranostic) χρήση του KLK7-ABP σε δερματικές παθολογίες, καθώς και σε καρκίνους των ωοθηκών και του παγκρέατος, όπου επίσης εμπλέκεται η KLK7. Με την ίδια στρατηγική αναπτύχθηκε ένας ΑΒΡ για την KLK6 (biotin-dPEG®4-His-Ile-Val-ArgP-(OPh)2) με σκοπό την ανίχνευση και ποσοτικό προσδιορισμό της ενεργούς KLK6 σε βιολογικά και κλινικά δείγματα, δεδομένου ότι η KLK6 εμπλέκεται στις νόσους Alzheimer και Parkinson, καθώς και σε διάφορους τύπους καρκίνων. Μέχρι σήμερα, ο ρόλος θεραποδιαγνωστικών ABPs για τις κυστεϊνοπρωτεϊνάσες καθεψίνες έχει μελετηθεί και αξιολογηθεί σε καρκίνους και καρδιαγγειακές παθήσεις (Ben-Nun et al., 2015; Weiss-Sadan et al., 2019). Στην παρούσα διατριβή, για πρώτη φορά αναπτύχθηκαν και αξιολογήθηκαν νέοι αναστολείς-ABPs για την KLK7 (Bisyris et al, 2021a and 2021b) και την KLK6 με διττές λειτουργίες φιλοξενούμενες σε έναν πεπτιδικό σκελετό, δηλαδή αναστολέα και ιχνηθέτη, και με ποικίλες δυνατές θεραποδιαγνωστικές εφαρμογές. Η εφαρμογή τους στην στόχευση των καλλικρεϊνών, την μεγαλύτερη οικογένεια σερινοπρωτεασών του ανθρώπινου γονιδιώματος, η οποία καταδείχθηκε στην παρούσα διατριβή, διευρύνει γενικότερα την χρήση των ABPs ως θεραποδιαγνωστικών μέσων (theranostic agents).</jats:p>
Pharmaceutics
Proteases are important enzymes in health and disease. Their activities are regulated at multiple... more Proteases are important enzymes in health and disease. Their activities are regulated at multiple levels. In fact, proteases are synthesized as inactive proenzymes (zymogens) that are activated by proteolytic removal of their pro-peptide sequence and can remain active or their activity can be attenuated by complex formation with specific endogenous inhibitors or by limited proteolysis or degradation. Consequently, quite often, only a fraction of the protease molecules is in the active/functional form, thus, the abundance of a protease is not always linearly proportional to the (patho)physiological function(s). Therefore, assays to determine the active forms of proteases are needed, not only in research but also in molecular diagnosis and therapy. Activity-based probes (ABPs) are chemical entities that bind covalently to the active enzyme/protease. ABPs carry a detection tag to enable localization and quantification of specific enzymatic/proteolytic activities with applications in mo...
Chemical Communications, 2021
Enzyme specific inhibitors can be designed based on endogenous substrate peptide motifs and modif... more Enzyme specific inhibitors can be designed based on endogenous substrate peptide motifs and modified to yield specific activity-based probes (ABPs). The development/validation of a theranostic ABP-inhibitor prototype for KLK7 protease is presented.
Organic & Biomolecular Chemistry, 2021
A mixed alkyl aryl phosphonate qABP for KLK7 was developed where the internally-quenching system ... more A mixed alkyl aryl phosphonate qABP for KLK7 was developed where the internally-quenching system is realeased upon binding of the qABP to the active enzyme.
<jats:p>Στην παρούσα διδακτορική διατριβή περιγράφεται ο σχεδιασμός και η σύνθεση ενός νέου... more <jats:p>Στην παρούσα διδακτορική διατριβή περιγράφεται ο σχεδιασμός και η σύνθεση ενός νέου ιχνηθέτη ενεργότητας (activity-based probe, ABP) και αναστολέων ειδικών για την καλλικρεΐνη 7 (KLK7), καθώς και η αποτίμηση των θεραπευτικών ιδιοτήτων τους in vivo. Η KLK7 είναι μία σερινοπρωτεάση η οποία έχει μελετηθεί ιδιαίτερα για τον ενεργό της ρόλο στην φλεγμονή και την αποφολίδωση του δέρματος, καθώς και σε διάφορους τύπους καρκίνου. Οι ιχνηθέτες ενεργότητας (ABPs) είναι μικρά μόρια ικανά να αναγνωρίζουν ειδικά τις καταλυτικώς ενεργές μορφές των ενζύμων. Η ιδιότητά τους αυτή, τους καθιστά μοναδικά και ιδιαίτερα χρήσιμα εργαλεία για την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση του ενεργού κλάσματος του ενζύμου, καθώς επίσης και για την in vivo απεικόνιση της ενζυμικής δραστηριότητας, με πολυάριθμες εφαρμογές στην βιοχημική ανάλυση, αλλά και στην μοριακή διάγνωση. Σημειώνεται ότι τα αντισώματα, που χρησιμοποιούνται στις διάφορες ανοσοδοκιμές, αναγνωρίζουν την ολική ποσότητα του ενζύμου στην οποία περιλαμβάνονται και ενζυμικώς ανενεργές μορφές, όπως για παράδειγμα προένζυμα, σύμπλοκα ενζύμου-αναστολέα, κολοβωμένες πρωτεΐνες που έχουν απωλέσει την ενζυμική ενεργότητα, κλπ. Για τον σχεδιασμό του ιχνηθέτη της KLK7 εφαρμόσαμε μια in silico προσέγγιση για τον προσδιορισμό ενός νέου υποστρώματος ειδικού για την KLK7. Τροποποίηση του πεπτιδικού υποστρώματος έδωσε τον φωσφωνικό αναστολέα (Boc-Phe-PheP-(OPh)2), ειδικό για την KLK7, ενώ ο ειδικός ιχνηθέτης ενεργότητας (biotin-X-X-Phe-PheP-(OPh)2) παρήχθη με βιοτινυλίωση του αναστολέα. Επιπλέον, συντέθηκε ένας ιχνηθέτης ABP με απόσβεση φθορισμού (KLK7-qABP, όπου q: quenched), ο οποίος αξιολογήθηκε in vitro με καθιερωμένες αναλυτικές μεθόδους, αλλά και με μία νέα μεθοδολογία ιστοχημικής ανάλυσης ενζύμων, την ακτιβογραφία (activography) (Pampalakis et al., Chem Commun (Camb) 53: 3246-3248, 2017). Πειραματικά δείχθηκε ότι ο ιχνηθέτης KLK7-ABP ανιχνεύει την ενεργή μορφή της ανθρώπινης KLK7, καθώς και την ενδογενή ανθρώπινη KLK7 και την Klk7 του ποντικού, σε εκχυλίσματα κυττάρων και βιοψίες δέρματος, αντίστοιχα. Οι θεραπευτικές δυνατότητες του αναστολέα και του ιχνηθέτη της KLK7 καταδείχθηκαν in vivo χρησιμοποιώντας ποντικούς Spink5-/-Klk5-/-. Το σύνδρομο Netherton είναι μια (ενίοτε θανατηφόρα) μορφή ιχθύωσης, η οποία χαρακτηρίζεται από παθολογική υπεραποφολίδωση του δέρματος και ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένη φλεγμονή στην επιδερμίδα, με αποτέλεσμα την εκτεταμένη βλάβη του δερματικού φραγμού. Η νόσος οφείλεται στην ανεπάρκεια του αναστολέα σερινοπρωτεασών LEKTI λόγω μεταλλάξεων στο αντίστοιχο γονίδιο SPINK5, με αποτέλεσμα την έκτοπη ενεργοποίηση της πρωτεόλυσης στην επιδερμίδα των ασθενών με σύνδρομο Netherton, αλλά και των ποντικών Spink5-/- που αναπαράγουν την ανθρώπινη νόσο, και αποτελούν καθιερωμένο πρότυπο για την μελέτη του συνδρόμου Netherton και της ατοπικής δερματίτιδας. Επίσης, έχει δειχθεί ότι η πρωτεάση KLK7 είναι ενεργοποιημένη στο δέρμα των ποντικών Spink5-/-Klk5-/-, στους οποίους έχει αδρανοποιηθεί η πρωτεάση Klk5, και εμπλέκεται αιτιολογικά στην παθολογία του δέρματος (Furio et al., 2015; Kasparek el al., 2017). Επομένως οι ποντικοί αυτοί αποτελούν ιδανικό πρότυπο για την δοκιμή και αξιολόγηση αναστολέων της πρωτεάσης Klk7. Επιδερμική χορήγηση τόσο του αναστολέα όσο και του ABP της KLK7 εξασθένισε σημαντικά την φλεγμονή και την υπεραποφολίδωση του δέρματος. Τα δεδομένα αυτά παρέχουν προκλινικές ενδείξεις για την δυνητική θεραπευτική και διαγνωστική (θεραποδιαγνωστική / therapeutic and diagnostic: theranostic) χρήση του KLK7-ABP σε δερματικές παθολογίες, καθώς και σε καρκίνους των ωοθηκών και του παγκρέατος, όπου επίσης εμπλέκεται η KLK7. Με την ίδια στρατηγική αναπτύχθηκε ένας ΑΒΡ για την KLK6 (biotin-dPEG®4-His-Ile-Val-ArgP-(OPh)2) με σκοπό την ανίχνευση και ποσοτικό προσδιορισμό της ενεργούς KLK6 σε βιολογικά και κλινικά δείγματα, δεδομένου ότι η KLK6 εμπλέκεται στις νόσους Alzheimer και Parkinson, καθώς και σε διάφορους τύπους καρκίνων. Μέχρι σήμερα, ο ρόλος θεραποδιαγνωστικών ABPs για τις κυστεϊνοπρωτεϊνάσες καθεψίνες έχει μελετηθεί και αξιολογηθεί σε καρκίνους και καρδιαγγειακές παθήσεις (Ben-Nun et al., 2015; Weiss-Sadan et al., 2019). Στην παρούσα διατριβή, για πρώτη φορά αναπτύχθηκαν και αξιολογήθηκαν νέοι αναστολείς-ABPs για την KLK7 (Bisyris et al, 2021a and 2021b) και την KLK6 με διττές λειτουργίες φιλοξενούμενες σε έναν πεπτιδικό σκελετό, δηλαδή αναστολέα και ιχνηθέτη, και με ποικίλες δυνατές θεραποδιαγνωστικές εφαρμογές. Η εφαρμογή τους στην στόχευση των καλλικρεϊνών, την μεγαλύτερη οικογένεια σερινοπρωτεασών του ανθρώπινου γονιδιώματος, η οποία καταδείχθηκε στην παρούσα διατριβή, διευρύνει γενικότερα την χρήση των ABPs ως θεραποδιαγνωστικών μέσων (theranostic agents).</jats:p>
Org. Biomol. Chem., 2021, 19, 6834–6841, 2021
Kallikrein 7 (KLK7) is a chymotrypsin-like serine protease with established roles in skin disease... more Kallikrein 7 (KLK7) is a chymotrypsin-like serine protease with established roles in skin diseases like the rare Netherton syndrome, an overdesquamating and inflammatory condition, but also common atopic dermatitis, and a potential drug target for these and possibly other diseases. Nevertheless, tools to determine the active KLK7 enzyme are not available. Here, a mixed alkyl aryl phosphonate quenched activitybased probe that detects the active KLK7 was developed and evaluated in vitro. This KLK7-qABP can potentially be used to monitor KLK7 activity in vivo. † Electronic supplementary information (ESI) available. See
Chem. Commun., 2021, 57, 6507–6510 , 2021
We applied a new in silico approach for using protease-substrate motifs to design a kallikrein 7 ... more We applied a new in silico approach for using protease-substrate motifs to design a kallikrein 7 (KLK7)-specific phosphonate activity-based probe (ABP) to quantify the active KLK7 in situ. Epidermal application of the ABP-inhibitor on Spink5 À/À Klk5 À/À mice, a Netherton syndrome model, reversed disease hallmarks, providing preclinical proof-ofconcept for using ABPs as theranostics.