Metodo UPLC-MS-MS con diluizione isotopica per l’analisi di melatonina, triptofano e metaboliti indolici correlati : applicazioni pilota a matrici complesse di origini vegetale ed umana (original) (raw)

2018

Abstract

RAZIONALE. La melatonina (MLT) \ue8 un potente neurormone prodotto in tracce dal triptofano nella ghiandola pineale dei mammiferi e coinvolto in molte funzioni fisiologiche: la regolazione dei ritmi circadiani di sonno-veglia, l\u2019immunostimolazione, la difesa antiossidante e dai tumori (1). Le piante producono MLT con funzioni simili: aumentare la resistenza allo stress, regolare i ritmi circadiani, promuovere la germinazione e la maturazione. Anche lieviti come Saccaromyces cerevisiae e altri ceppi producono MLT durante la vinificazione. Lo scopo della ricerca \ue8 ottimizzare una procedura analitica per identificare e quantificare l\u2019insieme dei metaboliti indolici del triptofano (indoloma) in matrici complesse vegetali e animali, per selezionare microrganismi alto-produttori di MLT per l\u2019alimentazione, misurare la farmacocinetica di MLT somministrata secondo diverse vie e formulazioni farmaceutiche a confronto con un kit ELISA e studiare l\u2019indoloma plasmatico di soggetti sottoposti a deregolazione dei cicli di buio-luce. MATERIALI E METODI. L\u2019analisi impiega un sistema di cromatografia liquida \u2013 spettrometria di massa composto da un cromatografo Dionex UltiMate\uae 3000 LC Systems (con autocampionatore, pompa binaria e termostato) e da uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo AB Sciex 3200 QTRAP\uae. La colonna UPLC \ue8 una Agilent Zorbax\uae Bonus-RP 80A Amide (3x100 mm; 3,5 \u3bcm). Come standard interni sono utilizzati la 5-F-Triptamina per tutti gli indoli, il D5-Ar-Triptofano e la OCD3-MLT per i rispettivi analiti. La separazione cromatografica \ue8 ottenuta con un gradiente di acido formico allo 0,1% e formiato di ammonio 5 mM in acqua (A) e acido formico 0,1% in metanolo (B), flusso 0,4 ml / min, volume di iniezione 10 \u3bcl, tempo totale di analisi 10 min. La preparazione dei campioni impiega la precipitazione delle proteine con acetonitrile - 0,1% acido formico e la SPE con cartucce Supelco HybridSPE-Phospholipid (30mg, 1 ml). RISULTATI. La scelta delle transizioni analitiche e delle condizioni strumentali ottimali \ue8 stata ottenuta con lo studio preliminare mediante infusione in modalit\ue0 di ionizzazione positiva di 11 composti (soluzioni singole, ~0,8 nM). Sono state misurate, con la funzione Ramp del software Analyst, le curve del Declustering Potential (DP) dello strumento (intervallo di \uf044V tra 0 e 70-90 V) e le curve di abbondanza dei frammenti in funzione dell\u2019energia di collisione (curve di breakdown nell\u2019intervallo di \uf044V tra 0 e 50-70 V). Tutte le elaborazioni sono state eseguite, a partire dai dati del software Analyst esportati come file .txt, in fogli di calcolo personalizzati (2), che calcolano i valori dei potenziali strumentali corrispondenti alla resa massima dei frammenti ionici identificati come reporter analitici, che sono stati poi utilizzati nel metodo finale. Il metodo cromatografico sviluppato separa e analizza 11 composti indolici in 10 min, con curve di calibrazione lineari (R2>0,998) nei due intervalli utili di concentrazione 0,012-1,25 ng (curva bassa) e 1,25-10 ng (curva alta). La presenza di triptofano ad elevate concentrazioni (69,7 e 18,4 \ub5g/ml, rispettivamente) in terreni YPD e YNB utilizzati per la fermentazione di lieviti \ue8 stata confermata, mentre tutti gli altri indoli ricercati sono risultati assenti. In estratti metanolici di farina di semi di soia \ue8 stato misurato triptofano libero (2,72 e 3,12 mg/g) e sono state identificate tracce di N-acetil-5OH-Triptamina (0,16 e 0,16 \ub5g/g) e di MLT (5,65 e 0,95 \ub5g/g). Questo metodo ha inoltre consentito di quantificare MLT nel plasma per lo studio di diverse formulazioni farmaceutiche e per la valutazione dei suoi ritmi circadiani nell\u2019uomo. 1. Lionella Palego, Laura Betti, Alessandra Rossi, Gino Giannaccini. Journal of Amino Acids Volume 2016, Article ID 8952520, 13 pageshttp://dx.doi.org/10.1155/2016/8952520 2. Rubino et al., Rapid Communications in Mass Spectrometry, 22(23), pp. 3935\u20133948. doi: 10.1002/rcm.3810

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