UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS DE BIOFÍSICA PRÁTICA IV -ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (original) (raw)

FORTALEZA DEZEMBRO DE 2017 1. INTRODUÇÃO A eletroforese consiste na migração de partículas livres carregadas em um meio sob a ação de uma diferença de potencial (SILVA-JUNIOR, 2001). Vários grupos como aminoácidos, proteínas e ácidos nucléicos possuem grupos ionizáveis e que, portanto, existem em soluções, em qualquer pH, como espécies carregadas eletricamente, positiva ou negativamente (WILSON & WALKER, 2010). Sob a influência de um campo elétrico essas partículas migram, de acordo com a lei de Coulomb, para o ânodo ou cátodo do sistema, dependendo da sua carga líquida. Assim, componentes de carga líquida negativa migram para o polo positivo e componentes de carga negativa migram para o polo positivo. A eletroforese é capaz de separar também partículas de mesma carga, mas com quantidades diferentes dessas cargas, o que reflete no tamanho molecular das moléculas (HENEIDE, 2010; WILSON & WALKER, 2010). Diversos fatores condicionam a migração e velocidade de corrida das moléculas no gel, como, por exemplo, o pH do meio, pI ou pK da molécula, temperatura e condições elétricas. As proteínas, por exemplo, são anfíons e sua carga elétrica depende do pH do meio. Assim, se o pH do sistema é superior ao pI da proteína, ela tem carga negativa e migra para o polo positivo. Se o pH do sistema é inferior ao pI da proteína ela tem carga positiva e migra para o polo negativo. Se o pH do sistema é igual ao pI da proteína, a carga efetiva é zero e a proteína fica em estado estacionário (HENEIDE, 2010). A manipulação do pH já é capaz de separar proteínas, o que torna a eletroforese um método simples e bastante útil. No entanto, o uso de substâncias anfipáticas que podem atribuir carga elétrica específica a essas moléculas, a migração vai ser condicionada pela natureza da carga da substância adicionada ao sistema (WILSON & WALKER, 2010). A capacidade de separação da eletroforese é determinada pela porosidade da fase fixa utilizada na corrida, sendo comum a utilização de géis, geralmente produtos de polimerização entre monômeros. Dois tipos comuns de gel utilizados em analises eletroforéticas são os géis de agarose e de poliacrilamida. A agarose é um polissacarídeo constituído por repetições de unidades de agarobiose. A propriedade gelificante é atribuída a formação de pontes de hidrogênio entre cadeias de agarose. O gel de poliacrilamida é formado na polimerização de monômero de acrilamida (WILSON & WALKER, 2010). Apesar dos dois géis poderem ser utilizados para separação de várias moléculas, se sua concentração for ajustada, comumente os géis de agarose são utilizados na análise de ácidos nucléicos por conterem uma malha mais espessa. A separação de proteínas costuma ser realizada no gel de poliacrilamida, que possui uma malha com poros de tamanho menor. A eletroforese é amplamente utilizada na pesquisa e na indústria pois permite a análise de enzimas, proteínas e ácidos nucleicos, auxilia na identificação de espécies, identifica linhagens e existência de parentesco, está presente em estudos de resistência à doenças e relação de patógenos e hospedeiros, entre outras aplicações. Dessa forma ela é uma técnica utilizada em todo o mundo e essencial para o desenvolvimento de estudos na área de biologia molecular.