Fluorescent dyes for detection of proteins of different folding degree. – Manuscript (original) (raw)

Актуальність теми. Аналітичні методи, що базуються на використанні «зовнішніх» флуоресцентних зондів є одним з найбільш широковживаних підходів для визначення та дослідження біологічних макромолекул. На сьогодні важливим завданням є розробка високочутливих зондів для визначення білків різних типів просторової організації, зокрема частково розгорнутих конформацій та агрегаційних утворень білків. Поряд з тим процеси помилкового згортання (місфолдингу), некерованої спонтанної агрегації білків і накопичення в клітині амілоїдних агрегатів пов'язані з патогенезом ряду важких захворювань, таких як хвороби Альцгеймера, Паркінсона, Кройцфельда-Якоба. Створення люмінесцентних аналітичних методів визначення конформаційно змінених або агрегованих білків є також важливим для контролю складу та якості рекомбінантних білків. Для флуоресцентної детекції амілоїдних фібрил традиційно застосовується барвник Тіофлавін Т (Тіо Т), що має ряд обмежень для використання та недоліків, зокрема низьку відтворюваність результатів. Для визначення олігомерних агрегатів білків і частково денатурованих конформацій використовують так звані «гідрофобні зонди», анілінонафталін сульфонатні барвники ANS та bis-ANS, але недоліком цих зондів є їх дуже низька специфічність. Отже, актуальною є розробка флуоресцентних барвників, структурночутливих до білків різних типів фолдингу, створення на їх основі методів детекції, дослідження конформаційних змін, вивчення взаємодії білок-білок та білок-ліганд. Представляє практичний інтерес розробка барвників, високоспецифічних до певного класу білків, зокрема альбумінів. Оскільки зміна вмісту альбумінів є маркером протікання ряду захворювань, то кількісне визначення цих білків є одним серед найбільш розповсюджених аналізів в біомедичних та клінічних дослідженнях. Створення зондів з високою афінністю до різних сайтів альбуміну надасть можливість вивчати процеси зв'язування та транспорту біологічно активних речовин. Неспецифічне визначення протеїнів в присутності денатуруючих агентів є найбільш широковживаним методом детекції для аналізу білків, що застосовується як в методиках гель-електрофоретичного розділення, так і для їх визначення у розчині. Для цього підходу розроблено ряд зондів, зокрема стирилціаніни SYPRO, що дозволяють визначати до 2 нг білку на поліакриламідних гелях. Але оскільки цей підхід все ширше застосовується в різних методах протеоміки, існує потреба у створенні зондів, що відповідають вимогам нових методів та забезпечують швидку, ефективну та зручну процедуру детекції білків. Важливим завданням досліджень є встановлення залежностей "структурафункція" барвників та формулювання критеріїв дизайну структурно-чутливих зондів для визначення білків. Вирішенню зазначених актуальних проблем присвячена дисертаційна робота. Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є частиною планових наукових досліджень, що виконувались у рамках держбюджетної теми "Синтез мезо-заміщених в поліметиновому ланцюгу